1、文章編號 1007 3949(201018 04 0265 04實驗研究羅格列酮對高糖誘導的血管內皮細胞炎癥的抑制作用牛紅心1,劉章鎖2,龍海波1(1.南方醫科大學珠江醫院腎內科,廣東省廣州市510282;2.鄭州大學第一附屬醫院腎內科,河南省鄭州市450052關鍵詞 糖尿病; 羅格列酮; 血管內皮細胞; 內皮功能失常摘 要 目的 闡明羅格列酮對糖尿病血管并發癥保護作用的分子機制。方法 用凝膠遷移分析和免疫熒光法測定不同濃度羅格列酮干預前后高糖誘導的血管內皮細胞核因子 B 激活和血管細胞黏附分子1表達的改變。結果 25mm o l/L D 葡萄糖刺激30m i n 可誘導細胞核因子 B 向核內

2、遷移(與基礎水平相比,P 0.001;5、25 mo l/L 羅格列酮以劑量依賴的方式抑制了D 葡萄糖誘導這種效應,抑制率分別為25.17%(P =0.001和51.79%(P 0.001。羅格列酮還抑制了D 葡萄糖誘導的血管細胞黏附分子1高表達。結論 羅格列酮通過抑制血管內皮細胞炎癥起到直接保護血管作用,可能是其延緩和改善糖尿病血管并發癥的機制之一。中圖分類號 R 96文獻標識碼 ARosiglitazone Prevents H igh G lucose I nduced I nfla mm ation in Vascular Endot helial CellsN I U H ong X

3、 i n 1,L IU Zhang Suo 2,and L ong H a i Bo 1(1.Depa rt m e n t of N e phrology,Zhujiang H ospital ,S ou t hern M edical Universit y ,Guang zhou,Guangd ong 510282,Ch i na;2.D e part m ent of N e phrology ,t h e F irstAffiliate d H ospit a l ,Z he ngzhou Universit y ,Zheng zhou,H enan 450052,Ch i na K

4、EY W ORDS D iabe tes ; R osig litazone ; V ascular Endothelial Ce lls ; Endo t he lial D ysf uncti on AB STRACT A i m T o c l a rify t he m o l ecular m echan is m of pro tecti ve effect o f ro si g li tazone on vascu lar co m plica ti on o f d i abetes . M e thods H u m an u m bilical vascu lar end

5、othe li a l ce lls (HUVECwere exposed to mediu m o r hi gh g lucose i n t he presence or absence o f d ifferen t doses o f ros i g litazone . N uc l ear translocati on of nuclear factor B (NF B w as m easured using the e lectrophoretic m ob ilit y sh ift assay and i m muno fluo rescence . Expressi o

6、n o f v ascu l a r ce ll adhesi on m o l ecule 1(V C AM 1w as deter m i ned by i m muno fl uo rescence . R esu lts 25mm o l/L D g l uco se sign ifi cantl y i nduced nu c lear translocati on of NF B i n HUV EC (P 0.001vs that of basa l l eve l ,wh ich w as prevented by 5and 25 m o l/L of ros i g lita

7、zone i n a dose dependen tm anner . T he s uppression ra te w as 25.17%(P =0.001and 51.79%(P 0.001. Ros i g litazone also prevented the i ncreased expressi on of VCAM 1i nduced by D g l ucose . Conc l usion R osig litazone d irectly protec ts vascular f unction v ia i nh i b ition o f i nfla mm atio

8、n i n vascular endothe li a l cell s and tha t i s perhaps one o f the m echan is m s of rosig litazone i m prov ing vascu l ar co m plica ti on o f diabetes .收稿日期 2010 02 21 修回日期 2010 04 08基金項目 廣東省自然科學基金(9451051501002540作者簡介 牛紅心,博士,副主任醫師,主要研究方向為氧化應激與腎臟疾病診治,E m ail 為nhongxi n126.co m 。劉章鎖,博士,主任醫師,教授

9、,博士研究生導師,主要研究方向為糖尿病腎病發病機制,E m ail 為zhangs uoLIUsina .co m 。龍海波,博士,主任醫師,副教授,主要研究方向為糖尿病腎病發病機制,E m ail 為l ym l hb cj hot m ai.l co m 。噻唑烷二酮(tiazolidined i o nes ,TZD 是治療2型糖尿病的口服藥,屬于胰島素增敏劑,通過激活過氧化體增殖物激活型受體 (per ox iso m e proliferator acti v ated receptors ga mm a ,PP AR 起作用,主要調節糖、脂代謝,改善胰島素抵抗,還具有改善內皮功能、

10、抑制系統炎癥等作用,對糖尿病大血管1和微血管2并發癥起保護作用。近期研究顯示,在細胞和分子水平,TZD 的生物學作用還可通過不依賴PP AR 激活的途徑來實現,如通過減少內皮素的合成和釋放、增加一氧化氮生物利用度、減少高糖誘導的氧化應激等3,然而其機制并不十分清楚。為了進一步明確TZD 對糖尿病血管并發癥保護作用的分子機制,本文以體外培養的人臍靜脈內皮細胞(hum an u m b ilical ve i n endo the li a l ce lls ,HUVEC 作為內皮模型,觀察羅格列酮干預前后高糖誘導的核因子 B(nuclear factor B ,NF B 激活和血管細胞黏附分子1

11、(vascular ce ll adhesion m olecule 1,VCAM 1表達的改變。1 材料和方法1.1 試劑RP M I 1640培養液(H yC lone ,Logan ,U tah,D 葡萄糖(S i g m a aldrich ,Lou is ,MO ,羅格列酮(葛蘭素史克,天津,中國,兔抗人NF B /p65、NF B /p50、VCAM 1抗體(San ta Cruz B iotechno logy ,I nc ,Santa C ruz ,C A ,FI T C 標記豬抗兔I gG(D akoCyto m ati o n,G lostr up,Den m ark,碘化

12、丙啶(prop i d i u m io d i d e,PI,S i g m a,D i g Ge lSh iftK it(Roche Applied Sc i ence,M annhe i m,Ger m any,NF B雙鏈寡核苷酸探針(Pr o m ega,M ad ison,W I,尼龍膜(Am ersha m,Sw e den。1.2 細胞培養按照我們以往的方法4分離和培養HUVEC。在37 、5%C O2和95%空氣條件下,細胞生長于含20%人AB血清、80kU/L青霉素、80m g/L鏈霉素的RP M I1640培養液中,以1 2傳代,第13代細胞用于實驗。1.3 凝膠遷移分析

13、法測定核因子 B激活HUVEC培養至接近匯合,在含1%人AB血清的RP M I1640培養液中靜止12h,分別將5、25 m o l/L羅格列酮提前1h加入培養液,再以25 mmo l/L D 葡萄糖刺激細胞30m in。以25mm o l/L 甘露醇作為對照。收集細胞,按照我們以往的方法5提取細胞核蛋白。按照試劑盒說明用D igox i g e n i n標記NF B寡核苷酸探針(探針序列為5 AGT TGA GGG GAC TTT CCC AGG C 3 和3 TCA ACT CCC CTG AAA GGG TCC G 5 。在結合反應體系(結合緩沖液4 L、polyd(I C1 g、po

14、ly L lysi n e 0.1 g、樣品核蛋白10 g、寡核苷酸探針3.5p m o l中使核蛋白樣本中NF B與已標記的寡核苷酸探針結合。為了檢測特異性,在一組反應體系中提前1h加入125倍未標記的NF B寡核苷酸探針,行競爭試驗。在另兩組反應體系中分別加入兔抗NF B/p65或NF B/p50抗體各2.5 g,4 條件下孵育12h,行超遷移試驗。反應結束后,在上述反應體系中各加入5 L上樣緩沖液,行6%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳,電轉印至正電荷尼龍膜,120 烤20 m in,漂洗和封閉后,加入堿性磷酸酶標記的抗D ig ox i n genin抗體,加入CSPD顯影、曝光,以Quant

15、ity One凝膠圖像分析系統(B io Rad,H ercules,C A分析結果。1.4 免疫熒光觀察核因子 B激活HUVEC培養在置有蓋玻片的細胞培養板上,生長至70%匯合,靜止后,分別將5、25 m ol/L羅格列酮提前1h加入培養液中,再以25mm o l/L D 葡萄糖刺激細胞30m in。固定、漂洗、封閉后,加入兔抗NF B/p65抗體(10m g/L,4 過夜,洗板,FI TC 標記豬抗兔Ig G(1 2037 避光孵育45m i n。洗后,PI(10m g/L室溫避光孵育10m in。在共聚焦顯微鏡(Le ica TCS SP2AOBS,Le i c a M icrosyst

16、e m s, Ca m bri d ge,UK下觀察、攝像。1.5 血管細胞黏附分子1表達的測定HUVEC培養于置有蓋玻片的細胞培養板上,生長至70%匯合,靜止后,將25 m o l/L羅格列酮提前1h加入培養液,再以25mm o l/L D 葡萄糖刺激細胞6h。用免疫熒光化學染色法檢測VCAM 1表達。一抗為兔抗VCAM 1抗體(1 100,其余方法同上。1.6 細胞活力的測定HUVEC培養至接近匯合,靜止后,用分別以25 mm o l/L D 葡萄糖處理細胞30m in和6h,及25 m o l/L羅格列酮處理1h。用MTT法測定細胞活力。1.7 統計學處理實驗重復3次或以上,數據以x s

17、表示。采用One w ay ANOVA比較總體及組間差異,對于方差齊的數據采用SNK和LSD作兩兩比較,對于方差不齊的數據采用DunnettT3作兩兩比較。2 結果2.1 高糖對血管內皮細胞核因子 B的影響2.1.1 凝膠遷移分析結果 25mm o l/L D 葡萄糖刺激30m i n可誘導細胞NF B向核內遷移,為基礎水平的9.52倍(P0.001,而甘露醇對NF B 無影響(P=0.985,提示NF B的激活是D 葡萄糖本身而非高滲透性作用造成的(表1和圖1。競爭試驗中使用過量未標記的NF B寡核苷酸探針抑制了NF B與標記的寡核苷酸探針的結合,抑制率為86.45%(與高糖組相比,P=0.

18、011,證實了核蛋白與DNA結合的特異性。在超遷移試驗中,使用特異性抗p65和p50抗體抑制了NF B與寡核苷酸探針的結合,抑制率分別為64.77%(與高糖組相比,P=0.038和70.51%(與高糖組相比,P= 0.024,說明NF B復合物主要由p65和p50構成(表2和圖2。又由于D 葡萄糖刺激30m in對細胞活力沒有影響(P=0.678,提示高糖對細胞NF B的影響也并非因細胞活力改變所致(表3。2.1.2 免疫熒光結果 為了進一步證實高糖對血管內皮細胞NF B的激活作用,用兔抗人p65抗體進行免疫熒光化學染色,共聚焦顯微鏡觀察發現未受刺激細胞胞漿有較強的綠色熒光(p65,而細胞核顯

19、示紅色熒光(PI;25mm o l/L D 葡萄糖刺激30m i n后,多數細胞胞核有明顯的綠色熒光著色,與PI的紅色熒光疊加后呈桔黃色(圖3。提示25 mm o l/L D 葡萄糖可誘導NF B/p65亞單位從胞漿向核內遷移。2.2 羅格列酮對高糖誘導的內皮細胞核因子 B 的抑制作用羅格列酮以劑量依賴方式抑制D 葡萄糖誘導的NF B激活,抑制率分別為25.17%(P=0.001和51.79%(P0.001;表1和圖1。25 m ol/L羅格列酮對細胞活力沒有影響(與溶媒對照組相比,P =0.794(表3,提示羅格列酮對高糖誘導的NF B激活的抑制作用并非因抑制細胞活力所致。免疫熒光化學染色顯

20、示,隨著羅格列酮濃度的增加,細胞核內綠色熒光(p65強度減弱,PI的紅色熒光強度增加。說明羅格列酮可以抑制D 葡萄糖誘導的NF B激活和NF B的核遷移,這種抑制作用隨羅格列酮劑量增加而增強(圖3。表1.羅格列酮對高糖誘導的核因子 B激活的抑制作用分 組n光密度比值溶媒對照組3 1.00 0.21高糖組39.52 0.96a高糖+5 mo l/L羅格列酮組37.12 1.07a b高糖+25 m ol/L羅格列酮組34.59 0.34a b甘露醇組3 1.01 0.20a為P0.01,與溶媒對照組相比;b為P0.01,與高糖組相比。表2.競爭試驗和超遷移試驗分 組n光密度比值高糖組3 1.00

21、 0.13高糖+未標記寡核苷酸探針組30.14 0.06a高糖+抗p65組30.35 0.02a高糖+抗p50組30.29 0.04aa為P0.05,與高糖組相比。表3.高糖和羅格列酮對細胞活力的影響分 組n吸光度比值溶媒對照3 1.00 0.12高糖處理30m i n30.95 0.23高糖處理6h30.94 0.05羅格列酮30.97 0.122.3 羅格列酮對高糖誘導的內皮細胞血管細胞黏附分子1表達的抑制作用免疫熒光化學染色可見HUVEC胞質中和胞膜上均有VCAM 1表達,細胞暴露于25mm o l/L D 葡萄糖6h后,VCAM 1蛋白表達增加,熒光強度增強。25 m ol/L羅格列酮

22、預孵育細胞明顯抑制了高糖誘導的VCAM 1蛋白高表達(圖4。同樣,25mm o l/L D 葡萄糖刺激6h(與溶媒對照組相比,P= 0.641和25 m o l/L羅格列酮刺激1h對細胞活力沒有影響(表3,說明高糖誘導VCAM 1高表達和羅格列酮對高糖誘導的VC AM 1的抑制作用與細胞 活力的改變無關。 圖4.羅格列酮對高糖誘導的血管細胞黏附分子1激活的影響( 400 從左到右依次為VCAM 1、PI和VCA M 1+PI;從上到下依次為溶媒對照組、高糖組和25 mo l/L羅格列酮組。3 討論大血管和微血管病變是糖尿病最主要的慢性并發癥,可導致腎功能不全、失明、心血管疾病等。高血糖使體內固

23、有免疫系統激活和微炎癥狀態持續存在,因此,新的觀點認為糖尿病本質上是一種炎癥性疾病6。內皮被覆于血管壁表面,直接感知血液循環中的信號(包括高血糖的刺激并做出相應的反應,內皮炎癥性損傷和內皮功能失常,與糖尿病的血管并發癥關系更為密切7。因此,將內皮炎癥和內皮功能失常作為干預的靶點,可能是預防和延緩糖尿病的血管并發癥的有效策略。NF B是氧化應激敏感的轉錄因子,激活后進入細胞核,與多種炎癥因子的DNA啟動子上NF B 序列結合,啟動多種促炎癥細胞因子、黏附分子、趨化因子和生長因子等的基因轉錄,從而參與機體防御功能和炎癥反應。NF B存在于內皮細胞,對血管內皮炎癥因子表達起關鍵調控作用。因此,抑制N

24、F B活性,可能成為控制血管炎癥、延緩和改善糖尿病血管并發癥的關鍵途徑。C eo l o tto等3發現羅格列酮可完全消除高糖誘導的血管內皮細胞內活性氧產生,由于NF B對氧化應激敏感,推測羅格列酮可能對NF B起作用。我們在用高糖刺激血管內皮細胞之前,在培養液中加入不同濃度的羅格列酮,結果顯示羅格列酮以劑量依賴的方式抑制了高糖誘導的血管內皮細胞NF B的激活。黏附分子是一類存在于細胞表面,介導細胞與細胞、細胞與細胞外基質相互作用的糖蛋白分子,其基因的表達受到NF B等轉錄因子的調控。VCAM 1主要由血管內皮細胞表達,在胞外含有免疫球蛋白樣結構域,可作為配體與白細胞表面表達的淋巴細胞相關抗原

25、1(LFA 1和巨噬細胞1(M ac 1分子結合,介導白細胞(特別是單核細胞與血管內皮細胞黏附和白細胞活化,促發炎癥反應。本研究結果顯示羅格列酮可以抑制高糖誘導的VCAM 1高表達,提示羅格列酮具有抑制糖尿病血管內皮炎癥的作用,這種作用可能是通過抑制轉錄因子的激活實現的。其它研究也表明,TZD可通過減輕氧化應激,改善糖尿病大鼠的內皮功能8,抑制TNF 誘導的內皮細胞細胞間黏附分子1(I CAM 1表達9,這些作用與PPAR 和代謝作用無關。本研究證明羅格列酮通過抑制血管內皮細胞NF B激活和黏附分子表達,而抑制糖尿病血管內皮炎癥,對糖尿病血管內皮功能起直接保護作用,為糖尿病慢性并發癥的防治提供

26、了新的途徑和理論依據。參考文獻1 劉寬芝,呂海莉,王偉超,等. 羅格列酮對2型糖尿病大鼠大血管病變的防治作用及其分子機制J. 中國動脈硬化雜志,2006,14(2:93 96.2 劉章鎖,牛紅心,程根陽,等. 羅格列酮對糖尿病大鼠腎保護機制的研究J. 中華腎臟病雜志,2004,20(2:109 112.3 Ceo l o t to G,G all o A,Pappare ll a I,e t a.l Rosi g lit azo ne reduces g l ucosei nduced ox i da ti ve stress m e d i ated by NAD(PH o x i dase

27、 v i a AMPK depe ndent m echanis mJ. A rteri o scl er T hro m b Vasc Biol,2007,27(12:2627 633.4 牛紅心,呂文成,閻曉. 人臍靜脈內皮細胞培養方法的改進及其優勢J. 廣東醫學,2009,30(11:1621 624.5 G uo Z J,N i uH X,H ou FF,et a.l A dvance d ox i da ti on pro t e i n products a cti vate vasc u l ar endothe li a l cells v i a a RAGE m ediate d si gnali ng pa t hway J. Antio x i d Redo x Si gnal,2008,10(10:1699 712.6 R i vero A,M ora C,MurosM,et a