1、脈沖電磁場對大鼠骨髓間充質干細胞增殖及成骨分化的影響(一)    【摘要】 目的：探討脈沖電磁場（PEMFs)對大鼠骨髓間充質干細胞（rMSCs）的影響. 方法：用全骨髓貼壁法分離rMSCs，對其進行1 Hz和15 Hz的PEMFs刺激，MTT法測定細胞增殖水平，檢測堿性磷酸酶活性，進行四環素熒光染色和鈣結節染色. 結果：rMSCs經PEMFs刺激后，各實驗組細胞增殖水平均有不同程度提高，差異具有統計學意義（P0.05），其中1 Hz，0.4 mT組改變最為明顯（3 d，0.323±0.051；5 d，0.714±0.058），對照組

2、（3 d，0.246±0.044；5 d，0.487±0.064），差異具有統計學意義（P0.01）；堿性磷酸酶檢測實驗組水平升高（5 d，0.348±0.032；15 d，2.339±0.034），對照組（5 d， 0.205±0.026；15 d，0.533±0.013），差異具有統計學意義（P0.05）， 四環素熒光染色和鈣結節染色結果均呈陽性. 結論：rMSCs經PEMFs刺激后，能促進體外培養rMSCs的增殖水平及成骨分化，磁場參數對實驗結果有影響. 【關鍵詞】 脈沖電磁場；骨髓間充質干細胞；增殖；成骨細胞0引言骨髓間充質干

3、細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）存在于骨髓基質系統中，具有自我更新能力和多向分化潛能，免疫原性弱1-3. 脈沖電磁場（pulsed electromagnetic fields，PEMFs) 能夠促進活細胞增殖及分化，刺激骨局部因子的產生，改善骨密度和生物力學特性4，用于骨折延遲愈合、骨不連、骨質疏松癥等骨科疾病5. 近年來，國內學者在這方面開始了大量研究工作，認為MSCs經12 Hz，1.1 mT的PEMFs合理刺激后，細胞增殖加速，符合成骨細胞的形態特征和生物學特性6. 利用恒磁場作用于骨組織中細胞，發現恒磁場處理可以促進MSCs向成骨方向分化7. 本實驗通過

4、觀察rMSCs在低頻率PEMFs的作用下增殖水平變化和細胞分化情況，以了解不同參數的PEMFs對rMSCs產生的影響.1材料和方法1.1材料SD仔鼠，1215 d，體質量3035 g，第四軍醫大學實驗動物中心提供. 骨愈合刺激儀（第四軍醫大學生物醫學工程系研制，ZL.0224739.4），治療頻率為15 Hz和1 Hz. 低糖DMEM（美國Hyclone公司）；胎牛血清（天津灝洋生物制品科技有限責任公司）；胰蛋白酶，茜素紅S（美國Sigma公司）；鹽酸四環素膠囊（西安利君制藥股份有限公司）；堿性磷酸酶試劑盒（中生北控生物科技股份有限公司）.1.2方法1.2.1rMSC的體外分離培養斷頸處死大鼠

5、，無菌條件下取其股骨和肱骨. 在PBS中將骨剪成12 mm3的小塊，100目篩網過濾后移入離心管中，1200 rpm離心5 min，棄上清，重懸浮于4 mL低糖DMEM中. 72 h后換液.1.2.2rMSCs生物學特性鑒定進行PAS過碘酸雪夫氏染色、油紅O染色和堿性磷酸酶（ALP）染色.1.2.3rMSCs生長曲線的繪制將原代細胞以5×106 cells/孔接種在24孔板上，第4日開始，每日消化3個孔，分別計數，求平均值繪制生長曲線. 將第3代細胞以1×104 cells/孔接種在24孔板上，第2日開始以同上方法繪制生長曲線.1.2.4刺激方法PEMFs發生儀頻率：15

6、Hz，1 Hz；磁感應強度：00.8 mT可調；線圈直徑：200 mm. 調整兩線圈距離至100 mm. 將線圈放置在孵箱中，刺激時將細胞放置在兩線圈中間位置. 調整需要的強度和頻率，刺激結束后，將對照組放在同樣位置相同時間. 刺激時間為每次3 h，1次/d.1.2.5MTT法檢測細胞增殖將rMSCs以1×104 cells/mL接種于7個96孔板中，每板接種32孔. 刺激方式為：T0組(對照組)；T1組(15 Hz，0.2 mT)；T2組(15 Hz，0.4 mT)；T3組(15 Hz，0.8 mT)；T4組(1 Hz，0.2 mT)；T5組(1 Hz，0.4 mT)；T6組(1

7、Hz，0.8 mT)，連續作用5 d. 接種第2日開始PEMFs作用. 第3日每板選擇16孔，加MTT（5 g/L）20 L，37孵育4 h，棄上清，加入DMSO 150 L，振蕩10 min，測定490 nm波長時各孔的吸光度A值. 第5日對其余孔做同樣檢測.1.2.6ALP活性檢測將rMSCs以每孔1×104 cells/mL接種于6個24孔板中，每板接種8孔，分為2組，每組3個板. 刺激方式為：T0組(對照組)，T1組(1 Hz，0.4 mT). 接種第2日開始PEMFs刺激，連續刺激15 d. 第3日選兩個板，測定ALP活性. 第5日和第15日各檢測2個板.1.2.7四環素熒

8、光標記將rMSCs以3×104 cells/mL接種于2個6孔板中，分為對照組與實驗組. 第2日開始對實驗組進行PEMFs刺激，每天刺激結束后，關閉儀器電源，將對照組放在相同位置相同時間. 培養18 d后對細胞進行四環素熒光標記. 熒光顯微鏡下觀察并采集圖像.1.2.8鈣結節染色將rMSCs以5×104 cells/mL接種于2個6孔板中，分為對照組與實驗組. 接種第2日開始PEMFs作用，對照組處理同前. 28 d后，用茜素紅S染液進行鈣結節染色. 倒置顯微鏡下觀察并采集圖像.統計學處理：數據以x±s表示，應用SPSS 12.0統計軟件進行分析，采用SNKq檢驗

9、和方差分析. 以P0.05為有統計學意義.2結果2.1形態學觀察及生物學鑒定接種前3 d可見大量大小不一，圓形懸浮細胞. 第5日大部分細胞呈成纖維細胞樣，第7日后，可見梭形細胞，部分形成集落，排列呈規則的輻射狀. 經23次純化處理，細胞形態趨于單一化，以梭形、三角形為主，呈集落生長趨勢（圖1）. 染色結果均為陰性，說明細胞不能分泌糖原、未向脂肪細胞及成骨細胞分化.2.2rMSCs生長曲線的繪制細胞生長曲線呈“S”形，具有穩定的潛伏期、對數增長期和平臺期. 可見傳代細胞生長周期明顯比原代細胞短（圖2）.23PEMFs對rMSCs增殖水平的影響PEMFs刺激3 d后，T1，T2，T4與對照組A值分

10、別為0.265±0.063，0.260±0.059，0.266±0.057和0.246±0.044，組間差異均無統計學意義（P>0.05）. T3，T5和T6組A值分別為0.288±0.060，0.323±0.051和0.300±0.042，與對照組相比差異均具有統計學意義（P0.05），以T5最為明顯. PEMFs刺激5 d后，各實驗組和對照組組間差異均具有統計學意義（P0.05），T5，T6和對照組A值分別為0.714±0.058， 0.720±0.069和0.487±0.064，組間

11、差異比較均具有統計學意義（P0.01）.2.4ALP活性檢測經PEMFs刺激后，實驗組與對照組A值3 d為0.225±0.017和0.185±0.025，差異無統計學意義（P>0.05）；5 d為0.348±0.032和0.205±0.026，差異具有統計學意義（P0.05）；15 d為2.339±0.034和0.533±0.013，差異具有統計學意義（P0.01）.2.5四環素熒光標記細胞8 d左右呈梭形分布，并出現融合，約16 d左右出現結節狀物. 繼續培養可見復層生長. 持續培養，中心出現圓形細胞結節. 培養21 d時，尚

12、無明顯鈣結節出現. 但四環素熒光標記后，鏡下細胞周圍基質聚集區呈明亮的黃色熒光區，陽性面積約占（10.1±1.2）%；對照組陽性面積約占（2.3±0.7）%. 兩者之間差異具有統計學意義（P0.01，圖3）.2.6鈣結節染色結果持續培養32 d后進行鈣結節染色，可見鈣結節成橘紅色，大小、形態各不相同，邊界清晰，呈火山狀突起，中間有黑色不透光顆粒，周圍為橘紅色，由中間向周邊顏色逐漸變淺，陽性面積約占（15.3±0.6）%；對照組陽性面積約占（9.6±0.8）%. 兩者之間有顯著差異（P0.01，圖4）.3討論本實驗采用全骨髓貼壁法，在沖洗骨髓腔時某些滋養細

13、胞和細胞因子會同時被沖出，與MSCs一同培養，可促使MSCs生長增殖旺盛，活力相對較強. 目前該類方法通常采用的是成年大鼠，雖然成年大鼠可以獲得較多的骨髓量，操作也相對方便，但成年大鼠體內MSCs的含量更少，增殖能力也較年幼的動物差，為此，我們采用了1215 d的大鼠. 根據生長曲線，選取34 d的傳代細胞用于實驗. MTT實驗結果顯示T5組可以顯著提高rMSCs增殖水平，提示該刺激參數可能是PEMFs刺激MSCs生長與增殖的一個“窗口”. 本實驗中，PEMFs作用3 d后，T1，T2，T4組均未能表現出提高細胞增殖水平的作用，但在作用5 d后，各組細胞增殖水平均有提高，說明對于不同的頻率和場

14、強，細胞需要不同的刺激時間，才可以對PEMFs產生有效的反應. 倒置相差顯微鏡下觀察到經PEMFs作用的rMSCs體積明顯較對照組大，細胞增殖能力旺盛，傳代周期明顯縮短，培養23 d即可進行傳代處理.PEMFs作用促進成骨細胞增殖、分化，加速了體外骨形成8. ALP是成骨細胞的早期標志酶，可標志成骨分化的開始. 有研究發現，MSCs向成骨細胞分化的過程中，ALP水平有時間依賴性，隨著誘導時間的延長表達量增加9. 本實驗結果顯示，經過5 d的刺激， rMSCs中可檢測到ALP的表達，并隨時間延長，表達水平逐漸增高，說明rMSCs向成骨細胞分化，并開始分泌骨基質. PEMFs刺激18 d，四環素熒

15、光標記可觀察到相當數量和面積的特征性金黃色，進一步證實rMSCs向成骨細胞分化，并促進了成骨細胞的體外骨形成. 繼續刺激，可肉眼觀察到圓形或卵圓形的礦化小結，經茜素紅染色為陽性，對照組也出現弱陽性反應. 可能的原因是由于培養液或血清的誘導，也可能是由于體外獲取的原代細胞含有少量成骨細胞，rMSCs的分離方法還需要進一步改進.PEMFs有促進rMSCs增殖和成骨分化兩方面的作用，是PEMFs有效治療骨折、骨質疏松等骨科疾病的可能機制之一. 但是將PEMFs用于促進rMSCs增殖以獲得大量組織工程種子細胞的時候，需要找到更好的磁場參數和培養條件，控制rMSCs的分化，這些都有待今后進一步深入探討.【參考文獻】1Sudeepta A, Pittenger MF. Human mesenchymal stem cells modulate allogeneic immune cell responses J. Blood, 2005