1、豬FMDV受體3亞基配體結(jié)合域的基因克隆及其多克隆抗體制備         11-02-08 11:08:00     編輯：studa20             作者：獨(dú)軍政, 高閃電, 常惠蕓, 叢國(guó)正, 林彤, 邵軍軍, 劉湘濤, 才學(xué)鵬【摘要】  目的: 克隆豬FMDV受體3亞基的配體結(jié)合域(LBD)基因, 利用原核細(xì)胞表達(dá)3亞基的LBD

2、片段, 純化目的蛋白后制備兔多克隆抗體。方法: 利用RT-PCR方法從FMDV實(shí)驗(yàn)感染豬的肺組織中克隆3亞基的LBD基因, 將其與pGEM T-easy載體相連構(gòu)建pGEM/3LBD, 經(jīng)BamH /Xho 酶切后回收3LBD片段, 與同樣酶切處理的原核表達(dá)載體pGEX 4T-1相連, 構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pGEX/3LBD, 將其轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3), 以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)3LBD蛋白。純化目的蛋白后免疫新西蘭白兔制備多克隆抗體。通過(guò)ELISA和Western blot鑒定血清效價(jià)和特異性。結(jié)果: 豬3亞基的LBD基因含有507個(gè)核苷酸, 編碼169個(gè)氨基酸, 豬3 LBD基因與牛、

3、人、 黑猩猩、 獼猴、 馬、 犬、 挪威大鼠、 家鼠、 和雞的3 LBD基因核苷酸序列同源性分別為90.3%、 92.3%、 92.1%、 91.3%、 90.5%、 90.3%、 87.8%、 85.2%、 79.5%。哺乳動(dòng)物的3亞基LBD基因同源性較高, 與雞的同源性較低。實(shí)現(xiàn)了重組豬3 LBD蛋白在大腸桿菌中的高效表達(dá), SDS-PAGE顯示其相對(duì)分子質(zhì)量（Mr）約為44 000, 制備的兔多克隆抗體效價(jià)達(dá)112800以上。結(jié)論: 實(shí)現(xiàn)了豬FMDV受體3 LBD的基因克隆、 原核表達(dá)和多克隆抗體的制備, 為深入研究受體3亞基在FMDV感染過(guò)程中的作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。 【關(guān)鍵詞】

4、0; FMDV病毒受體 豬3LBD基因 原核表達(dá) 多克隆抗體Abstract  AIM: To clone and express the ligand binding domain (LBD) cDNA of porcine integrin 3 as foot-and-mouth disease virus (FMDV) receptor and prepare its polyclonal antibody. METHODS: The LBD cDNA of porcine 3 was obtained from the lung tissue of pig infected

5、with FMDV by RT-PCR, and the recombinant plasmid pGEM/3LBD was constructed. After digested with BamH /Xho , the 3LBD fragment was subcloned into prokaryotic expression vector pGEX 4T-1. The recombinant expression plasmid pGEX/3LBD was constructed and transformed into E.coli BL21(DE3). The recombinan

6、t porcine 3LBD protein was expressed after IPTG induction and purified from total protein of BL21(DE3). The rabbits from New Zealand were immunized with the purified fusion protein to prepare polyclonal antibody, which was identified by Western blot and ELISA. RESULTS: The 507 bp cDNA of porcine 3LB

7、D encoded a polypeptide of 169 amino acids. The similarity of nucleotide sequence 3LBD between pigs and cattle, human being, chimpanzees, rhesus monkeys, horses, dogs, Norway rats, mice, chickens was 90.3%, 92.3%, 92.1%, 91.3%, 90.5%, 90.3%, 87.8%, 85.2%, 79.5%, respectively. The 3LBD gene of mammal

8、s exhibited high sequence homology. The recombinant 3LBD protein was expressed efficiently as inclusion body after IPTG induction and was approximately 44 000. The titer of the polyclonal antibody against the purified 3LBD protein was about 112800 by ELISA. CONCLUSION: The gene cloning and expressio

9、n of 3LBD and the preparation of its polyclonal antibody lay a foundation for further research into the interaction of FMDV with 3 subunit of porcine integrin.KeywordsFMDV receptor; ligand binding domain cDNA of porcine 3; prokaryotic expression; polyclonal antibody病毒感染宿主細(xì)胞的第一個(gè)步驟是病毒與受體結(jié)合, 在受體的介導(dǎo)下病毒粒

10、子才能進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的口蹄疫病毒（foot-and-mouth disease, FMDV）受體分為類: 整聯(lián)蛋白（integrin）和硫酸乙酰肝素（heparan sulfate proteoglycans, HSPG）1。口蹄疫田間分離毒株僅利用整聯(lián)蛋白作為受體, 而口蹄疫細(xì)胞適應(yīng)毒株則除了利用整聯(lián)蛋白外, 還可利用HSPG作為受體。許多實(shí)驗(yàn)表明,   HSPG對(duì)FMDV來(lái)說(shuō)可能是一種替換受體, 或是該病毒感染進(jìn)入細(xì)胞的一種旁路途徑2。整聯(lián)蛋白可與含有精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Giy-Asp, RGD）基序的蛋白配體結(jié)合, 而RGD基序在FMDV VP1的

11、G-H環(huán)中高度保守, 這是整聯(lián)蛋白成為FMDV受體的分子基礎(chǔ)。1995年, Berinstein等3發(fā)現(xiàn)人源玻連蛋白（vitronectin）受體v3的抗血清和v3的單克隆抗體（mAb）均能阻斷FMDV對(duì)易感細(xì)胞的感染, 由此認(rèn)為v3是該病毒的細(xì)胞受體。這是第一個(gè)被發(fā)現(xiàn)的FMDV 受體。v和3亞基均有自己特異的配體結(jié)合域（ligand-binding domain, LBD）, 可與病毒配體相互作用。研究表明, 3亞基胞外域中的169個(gè)氨基酸參與構(gòu)成了LBD4。雖然體外實(shí)驗(yàn)證明FMDV可以利用人整聯(lián)蛋白作為受體進(jìn)入細(xì)胞, 但在自然條件下這種病毒并不引起人類的疾病, 為了闡明FMDV與自然宿主豬

12、的相互作用關(guān)系, 繼制備了牛vLBD多克隆抗體后5, 本試驗(yàn)首次從FMDV實(shí)驗(yàn)感染豬的肺組織中克隆到了3亞基LBD基因并對(duì)其核苷酸序列和推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行了比較分析, 實(shí)現(xiàn)了重組豬3LBD的高效表達(dá)并制備了兔多克隆抗體, 這為深入揭示豬v3受體在FMDV感染過(guò)程中的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。1  材料和方法1.1  材料  FMDV實(shí)驗(yàn)感染豬肺組織、 大腸桿菌菌株DH5和BL21（DE3）、 原核表達(dá)載體pGEX 4T-1均由家畜疫病病原生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存; RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司; 限制性核酸內(nèi)切酶、 IPTG、 X-gal、 DNA marker

13、、 DNA片段純化試劑盒、 one step RT-PCR試劑盒均購(gòu)自寶生物（大連）公司; T4連接酶為Promega公司產(chǎn)品; 低分子量蛋白標(biāo)準(zhǔn)購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞生化所; 溶菌酶、 弗氏佐劑均為Sigma公司產(chǎn)品; 硝酸纖維素（NC）膜、 透析袋為Pharmacia公司產(chǎn)品; HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司; 其他試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純。健康新西蘭大白兔（3月齡, 雄性, 體質(zhì)量約2 kg）由蘭州獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物場(chǎng)提供。1.2  方法1.2.1  引物  參考GenBank中不同動(dòng)物來(lái)源的3基因序列設(shè)計(jì)2條引物: P1: 5-

14、GTGGGATCCCCCCAGCGGATCTTGCTCCG3; P2: 5-CGACTCGAGCTTGGCATCGGCGGTAAACA-3, 這對(duì)引物用于擴(kuò)增豬3亞基的LBD基因, 預(yù)期大小約500 bp。P1和P2引物的5端分別引入了酶切位點(diǎn)BamH和Xho, 用于構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒。1.2.2  RNA提取與RT-PCR  將豬肺組織置于液氮預(yù)冷的研缽中, 研磨至無(wú)肉眼可見(jiàn)顆粒, 期間不斷加入少量液氮, 參考RNA提取試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA。按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行RT-PCR反應(yīng), PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。1.2.3  基因克隆與序列分析&

15、#160; 將純化的PCR產(chǎn)物和pGEM T-easy載體進(jìn)行連接、 轉(zhuǎn)化, 小劑量制備質(zhì)粒, PCR、 酶切鑒定后將初步確定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒pGEM-3LBD送上海生工生物工程公司測(cè)序。重組質(zhì)粒序列測(cè)定后, 借助DNAstar、 BioEdit、 Mega3.1等生物學(xué)軟件對(duì)所測(cè)序列與參考序列比較分析。參考基因及GenBank登錄號(hào)為: 牛3(AF239959)、 人3（J02703）、 獼猴3(XM001116013 )、 犬3(AF116270)、 家鼠3(BC125518)、 挪威大鼠3(NM153720)、 馬3（NM001081802）、 黑猩猩（XM523684）、 雞3（NM2

16、04315）。1.2.4  重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建和表達(dá)  重組質(zhì)粒pGEM-3LBD經(jīng)BamH/Xho雙酶切后, 回收3LBD片段, 與同樣酶切處理的pGEX 4T-1載體連接, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5, 隨機(jī)挑取單個(gè)菌落小劑量制備質(zhì)粒, PCR、 酶切、 測(cè)序鑒定, 將測(cè)序正確的重組質(zhì)粒pGEX/3LBD轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3), 挑取單菌落接入10 mL LB/Ampr 培養(yǎng)液中, 37振搖培養(yǎng)過(guò)夜, 次日按1100將菌液接入LB/Ampr培養(yǎng)液, 37振搖培養(yǎng)24 h至A600值達(dá)到0.30.5時(shí), 加IPTG至終濃度1 mmol/L, 繼續(xù)培養(yǎng)46 h后進(jìn)行SDS-

17、PAGE分析目的蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)情況。1.2.5  蛋白純化及其多克隆抗體的制備  將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體收集后, 離心收集沉淀, 加入超聲緩沖液冰上間歇超聲, 離心棄上清, 重復(fù)上述步驟34次。沉淀加適量上樣緩沖液, 重懸后沸水煮5 min后上樣, 電泳結(jié)束后用預(yù)冷的0.1 mol/L KCl 浸泡膠至顯示出乳白色的蛋白條帶, 切下目的條帶放入透析袋內(nèi), 用水平電泳洗脫裝置洗脫目的蛋白, 取樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。以純化的3LBD蛋白免疫3月齡雄性新西蘭大白兔。初次免疫用500 g重組蛋白, 與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻后于背部皮下多點(diǎn)注射。4周后第1次加強(qiáng)免疫用250 g重組蛋白, 與等體積的不完全弗氏佐劑混勻后于背部皮下多點(diǎn)注射。之后隔2周加強(qiáng)免疫1次, 并于2次加強(qiáng)免疫后第10天經(jīng)心臟大量采血, 按常規(guī)方法分離制備血清。以ELISA方法和Western blot分析確定抗體的效價(jià)和特異性。2