1、氣相色譜質譜法檢測豬肌肉中8種性激素的殘留曾東平，林翠萍，曾振靈，黃顯會，賀利民（華南農業大學獸醫學院/廣東省獸藥研制與安全評價重點實驗室，廣州 510640）摘要：【目的】建立己烯雌酚、甲睪酮、炔諾酮、17-乙炔雌二醇、雌二醇、6-甲基-17-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇和乙酸氯地孕酮8種性激素在豬肌肉中殘留的氣相色譜質譜（GC-MS）檢測和確證方法。【方法】豬肌肉樣品經過初提，去脂肪，固相萃取小柱凈化，衍生化，最后用GC-MS檢測和確證。【結果】此法在濃度2.550g·kg-1保持良好的線性，相關系數大于0.97，在2.5、10、50g·kg-1的添加水平上，8種性激素各組分

2、的回收率（%）、批內變異系數（%）、批間變異系數（%）的范圍分別為：己烯雌酚78.5148、6.312和8.910，甲睪酮70.8109、4.111和6.67.5，炔諾酮69.887.2、4.010和6.78.8，17-乙炔雌二醇67.7120、4.212和9.310，雌二醇82.8103、0.410和6.811，6-甲基-17-羥基孕酮70.399.2、2.79.3和5.97.8，苯甲酸雌二醇73.0104、5.412和9.712，乙酸氯地孕酮72.991.8、3.39.2和8.08.6。檢測限和定量限（g·kg-1）分別為：己烯雌酚0.99和3.30；甲睪酮1.05和3.50；炔

3、諾酮 1.19和3.97；17-乙炔雌二醇0.94和3.13；雌二醇 1.45和4.83；6-甲基-17-羥基孕酮1.56和5.20；苯甲酸雌二醇 1.92和6.40；乙酸氯地孕酮2.41和8.03。【結論】所建立的檢測方法具有簡便、準確、靈敏、適用性強及有機溶劑污染小等特點。關鍵詞：性激素；GC-MS；多殘留檢測；豬肌肉Multi-Residue Determination of Eight Anabolic Steroids by GC-MS in Muscle Tissues from Pig ZENG Dong-ping, LIN Cui-ping, ZENG Zhen-ling, H

4、UANG Xian-hui, HE Li-min(Laboratory of Veterinary Pharmacology/ College of Veterinary Medicine, South China Agricultural University, Guangzhou 510640)Abstract: 【Objective】A GC-MS method for determination of eight anabolic steroids (diethylstilbestrol, methyltestosterone, norethindrone, 17-ethynylest

5、radiol, estradiol, 6-methyl-17-hydroxy-progesterone, estradiol benzoate, chlormadinone acetate) was developed. 【Method】Muscle samples were extracted with liquid-liquid extraction and clean-up was performed in two steps, the extracts obtained were derivatized with heptafluorbutyric (HBF) anhydride an

6、d analyzed by GC-MS.【Result】In the above method, the linear scope was 2.5-50 (g·kg-1). The range of the recoveries was 78.5%-148% for diethylstilbestrol, 70.8%-109% for methyltestosterone, 69.8%-87.2% for norethindrone, 67.7%-120% for 17-ethynylestradiol, 82.8%-103% for estradiol, 70.3%-99.2% f

7、or 6-methyl-17-hydroxy-progesterone, 73.0%-104% for estradiol benzoate, 72.9%-91.8% for chlormadinone acetate. The range of the coefficients of variation within batches was 0.4%-12%; The range of the coefficients of variation between batches was 6.4%-11%. The limit of detections and the detection ca

8、pability was 0.99, 3.30 g·kg-1 for diethylstilbestrol, 1.05, 3.50 g·kg-1 for methyltestosterone, 1.19, 3.97 g·kg-1 for norethindrone, 0.94, 3.13 g·kg-1 for 17-ethynylestradiol, 1.45, 4.83 g·kg-1 for estradiol, 1.56, 5.20 g·kg-1 for 6-methyl-17-hydroxy-progesterone, 1.92

9、, 6.40 g·kg-1 for estradiol benzoate, 2.41, 8.03 g·kg-1 for chlormadinone acetate. 【Conclusion】These results showe that the method is widely available, accurate and sensitive.Key words: Anabolic steroids; GC-MS; Multi-residue determination; Pigs0 引言【研究意義】性激素為性腺分泌一類甾體激素，包括雌激素、孕激素和雄激素。臨床多用人工

10、合成品及其結構改造物1。此類藥物主要用作動物的同期發情等，還具有加快動物的生長發育和育肥的作用。因此，20世紀70年代以前，許多國家和地區均將雌激素或其它同化激素用作畜禽的促生長劑，以在畜牧生產中達到改善生產性能和產量目的。后來研究發現雌激素具有致癌作用，許多國家先后禁止將性激素用作促生長劑25。中國亦明令禁止將生殖激素（如性激素、促性腺激素及性激素等）、具有雌激素樣作用的物質（如玉米赤霉醇等）等作為動物的促生長劑使用，但目前中國非法將這類藥物用于畜禽、水產養殖上的報道時有發生，這必然引起藥物在動物體內及動物性食品中的殘留。【前人研究進展】國外對性激素多殘留的檢測方法研究報道很多，歐盟、美國F

11、DA也均規定了檢測方法6,7，但國內有關此類藥物多殘留檢測方法的報道較少。報道的檢測方法包括高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）8、高效液相色譜質譜聯用（high performance liquid chromatography-mass spectrometry，HPLC-MS）911、氣相色譜法（gas chromatography，GC）12、氣相色譜質譜聯用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）1320以及酶聯免疫吸附法（ELISA）21等。其中，以氣相色譜質譜聯用的

12、方法最為廣泛，歐盟對此研究較多，早在20世紀90年代初開始就一直在研究1420。【本研究切入點】本研究以8種具有代表性的性激素，包括己烯雌酚（diethlstilbestrol，des）、甲睪酮（methyltestosterone）、炔諾酮（norethindrone）、17-乙炔雌二醇（17-ethynylestradiol）、雌二醇（estradiol）、6-甲基-17-羥基孕酮（6-methyl- 17-hydroxy-progesterone）、苯甲酸雌二醇（estradiol benzoate）、乙酸氯地孕酮（chlormadinone acetate），建立這8種性激素在豬肌肉中

13、殘留GC-MS檢測方法，為監測性激素在動物組織中的多殘留，保障動物源性食品安全提供基礎研究。【擬解決的關鍵問題】上述8種性激素中均含有羥基或酯化結構，選用七氟丁酸酐（heptafluorobutyric acid，HFBA）衍生化后，結合高靈敏度的要求和本實驗室GC-MS檢測器配置的情況，選擇GC-MS進行檢測方法的探討。1 材料與方法1.1 儀器和試劑氣相色譜質譜儀：GC XL-Turbomass PerkinElmeer，美國PE公司；固相萃取裝置：WAT058833，美國沃特斯公司；氮吹儀：N-EVAPTM 111，美國Organomation Associates，Inc；臺式高速離心

14、機：Centrifuge 5804，德國Eppendorf公司；精密數顯酸度計：PHS-3G，上海雷磁儀器廠；Si-SPE小柱：500 mg、3 ml，美國Supelco公司；NH2-SPE：500 mg、3 ml，美國Supelco公司；C18-SPE：500 mg、3 ml，美國Supelco公司；已烯雌酚：含量99%，批號101K1948，Sigma公司；甲睪酮：批號0172-9702，中國藥品生物制品檢定所；炔諾酮：含量99%，批號58H0858，Sigma公司；17-乙炔雌二醇：含量98%，批號52K1606，Sigma公司；雌二醇：批號10182-0002，中國藥品生物制品檢定所；

15、6-甲基-17-羥基孕酮：含量99%，批號059H0579，Sigma公司；苯甲酸雌二醇：批號0006-9703，中國藥品生物制品檢定所；乙酸氯地孕酮：含量98%，批號010K1606，Sigma公司；七氟丁酸酐（HFBA）：批號LB21599，Supelco公司；乙醚、甲醇、石油醚、氯仿、正己烷、丙酮、醋酸鈉、醋酸：分析純，廣州化學試劑廠。1.2 溶液配制1.2.1 8種性激素標準貯備液 分別稱取8種性激素50 mg，置于8個50 ml棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即成1 000 g·ml-1的8種性激素標準貯備液，4 ，避光保存，存放期為1個月。臨用前，取此貯備液用甲醇稀

16、釋成工作濃度標準溶液。1.2.2 甲醇水溶液（甲醇/水，41，V/V） 分別量取100 ml雙蒸水與400 ml甲醇，混勻，備用，新鮮配制。1.2.3 洗脫液（氯仿/丙酮，41，V/V） 分別量取100 ml丙酮與400 ml氯仿，混勻，備用，新鮮配制。1.2.4 衍生化試劑（HFBA/丙酮）（14，V/V） 10 l HFBA溶解于40 l丙酮中，新鮮配制。1.3 樣品前處理1.3.1 樣品制備 取空白豬肌肉絞碎勻漿，20保存，備用。1.3.2 液液萃取 參考Stolker等14的方法，準確稱取勻漿后的豬肌肉樣品5 g，置于50 ml的離心管中，靜置1 min，加入10 ml乙醚22，以2

17、000 r/min漩渦混勻1 min，以300 r/min振蕩20 min，以7 000 r/min離心10 min，收集提取液在40水浴、氮氣流下揮干，加入4 ml甲醇/水溶液（41；V/V），再加入4 ml石油醚，以2 000 r/min漩渦混勻1 min，以300 r/min振蕩10 min，以3 000 r/min離心10 min，去掉上層石油醚，收集甲醇水溶液（底層）在55水浴氮氣流下揮干，最終體積大約為0.5 ml。然后加入2 ml雙蒸水和4 ml乙醚，以2 000 r/min漩渦混勻1 min，以300 r/min振蕩10 min，以3 000 r/min離心10 min，收集提

18、取液在40 水浴氮氣流下揮干。殘留物溶解于0.5 ml氯仿中，加入5 ml正己烷。1.3.3 固相萃取 硅膠固相萃取小柱（Si-SPE）先以5 ml正己烷活化，上樣，再用2.5 ml正己烷洗滌，然后將Si-SPE接在氨基固相萃取小柱（NH2-SPE）上，用5 ml正己烷洗滌，最后用5 ml氯仿/丙酮（41，V/V）溶液洗脫藥物，收集洗脫液于10 ml磨口尖底玻璃試管中，于60 水浴氮氣流下揮干。1.3.4 樣品的衍生化 參考Impens等23的方法，揮干物放入60 烘箱，靜置10 min，去除水分后，加入50 l HFBA/丙酮溶液（14，V/V），以2 000 r/min漩渦混勻1 min，

19、置于60烘箱中，反應1 h，反應完后，加入700 l甲苯，然后加入500 l雙蒸水，以2 000 r/min漩渦混勻1 min，以3 000 r/min離心10 min，取上層600 l進樣GC-MS檢測。1.4 色譜、質譜條件與工作指標色譜條件：進樣口溫度為280，柱溫升溫程序為120保持2 min，以15/min的速度升至250并保持2 min，再以4 /min的速度升溫至280 保持5 min，載氣流速為1.0 ml·min-1，進樣量為2 l，進樣不分流；質譜條件：電子能量70 eV，發射電流（燈絲）200 A，檢測器電壓524 V，離子源溫度200，接口溫度為280。1.5

20、 標準曲線與線性范圍準確稱量5 g勻漿后的空白豬肌肉于7只50 ml塑料離心管，各依次加入100 l系列濃度的性激素混合標準工作液，制得0、2.5、5、10、20 、40和50 g·kg-1添加水平的樣品，將上述樣品，漩渦混勻后，靜置10 min，按照“1.3”和“1.4”進行處理和測定，將測得的性激素的色譜面積（S）與相對應的濃度（C）作直線回歸，求得標準曲線回歸方程和相關系數，共作4次重復。1.6 回收率與變異系數的測定精確量取100 l性激素的混合標準工作液加入5 g空白豬肌肉組織中，制得對應濃度分別為0、2.5、10和50 g·kg-1 4個濃度添加水平，放置10

21、min，按照“1.3”和“1.4”進行處理和測定。同時取對應濃度的混合標準溶液，按照性激素GC-MS確證方法，進行衍生化與色譜分析，批內每一樣品重復6次，共作4個批次。以峰面積計算，求其回收率與變異系數。1.7 檢測限、定量限的確定準確稱取5 g勻漿后的空白豬肌肉樣品分置于15個50 ml的塑料離心管，制得對應濃度分別為0、1、2、4和5 g·kg-14個濃度添加水平，每個樣品重復3次，然后按照“1.3”和“1.4”的方法進行處理與衍生化測定。以最低檢出濃度的峰進行信噪比計算，3倍信噪比定義為檢測限，10倍信噪比定義為定量限。2 結果與分析2.1 色譜圖對混合物進行全掃描色譜圖，如圖

22、1所示。結果表明，在本試驗所采用的條件下，8種性激素都可以得到有效的分離，性激素各組分選擇離子：已烯雌酚303，341，417，447；甲睪酮355，369，465，480；炔諾酮143，461，476，477；17-乙炔雌二醇115，353，446，474；雌二醇169，356，409，451；6-甲基-17-羥基孕酮133，383，479，480；苯甲酸雌二醇146，540，541；乙酸氯地孕酮461，497，540。19保留時間分別代表：順式己烯雌酚、反式己烯雌酚、甲睪酮、炔諾酮、17-乙炔雌二醇、雌二醇、6-甲基-17-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇、乙酸氯地孕酮。保留時間（1720 min）

23、代表柱流失1: Cis-diethylstilbestrol; 2: Trans-diethylstilbestrol; 3: Methyltestosterone; 4: Norethindrone; 5: 17-ethynylestradiol; 6: Estradiol; 7: 6-methyl-17- hydroxy-progesterone; 8: Estradiol benzoate; 9: Chlormadinone acetate; Retention time (17-20 min): column bleeding圖1 性激素（12.5 g·ml-1）HFB衍生化

24、后總離子流圖Fig. 1 GC-MS full ion chromatogram of HFB-derivative for anabolic steroids (12.5 g·ml-1)藥物的出峰順序依次是己烯雌酚、甲睪酮、炔諾酮、17-乙炔雌二醇、雌二醇、6-甲基-17-羥基孕酮、苯甲酸雌二醇、乙酸氯地孕酮，各組分分離度高，色譜峰形好，保留時間合理。在選擇離子模式下，性激素各組分HFB衍生物離子流圖如圖2所示；豬肌肉空白樣品HFB衍生物選擇離子流圖如圖3所示；豬肌肉添加樣品各組分HFB衍生物選擇離子流圖如圖4所示。19保留時間（min）分別代表：順式己烯雌酚（9.59）、反式己烯

25、雌酚（10.35）、甲睪酮（11.78）、炔諾酮（12.22）、17-乙炔雌二醇（12.62）、雌二醇（13.50）、6-甲基-17-羥基孕酮（15.44）、苯甲酸雌二醇（16.63）、乙酸氯地孕酮（21.30）Retention time (min) 1=cis-diethylstilbestro (9.58), 2=trans-diethylstilbestrol (10.34), 3=methyltestosterone (11.77), 4=norethindrone (12.21), 5=17- ethynylestradiol (12.61), 6=estradiol (13.43

26、), 7=6-methyl-17-hydroxy-progesterone (15.43), 8=estradiol benzoate (16.62), 9=chlormadinone acetate (21.28)圖2 混合標準溶液（12.5 g·ml-1）各組分HFB衍生物選擇離子流圖Fig. 2 GC-MS selected-ion monitoring chromatograms of HFB-derivative for anabolic steroids (12.5 g·ml-1)空白樣品中能與性激素各組分的保留時間較好的分開，不產生干擾Retention ti

27、me was not interfered with the blank samples圖3 豬肌肉空白樣品HFB衍生物選擇離子流圖Fig. 3 GC-MS selected-ion monitoring chromatograms of HFB-derivative for control pork2.2 標準曲線在添加濃度2.550 g·kg-1添加水平上，各組分皆能保持良好的線性，相關系數大于0.97。2.3 回收率與變異系數按“1.6”求得豬肌肉中性激素各組分在高（50 g·kg-1）、中（10 g·kg-1）、低（2.5 g·kg-1）3個濃1

28、9保留時間（min）分別代表：順式己烯雌酚（9.58）、反式己烯雌酚（10.34）、甲睪酮（11.77）、炔諾酮（12.21）、17-乙炔雌二醇（12.61）、雌二醇（13.43）、6-甲基-17-羥基孕酮（15.43）、苯甲酸雌二醇（16.62）、乙酸氯地孕酮（21.28）Retention time (min) 1=cis-diethylstilbestro (9.58), 2=trans-diethylstilbestrol (10.34), 3=methyltestosterone (11.77), 4=norethindrone (12.21), 5=17- ethynylestra

29、diol (12.61), 6=estradiol (13.43), 7=6-methyl-17-hydroxy-progesterone (15.43), 8=estradiol benzoate (16.62), 9=chlormadinone acetate (21.28)圖4 豬肌肉添加樣品（10 g·kg-1）各組分HFB衍生物選擇離子流圖Fig. 4 GC-MS selected-ion monitoring chromatograms of HFB-derivative for anabolic steroids in pork (10 g·kg-1)度的回收

30、率與變異系數，8種性激素各組分的回收率（%）、批內變異系數（%）、批間變異系數（%）的范圍分別為：己烯雌酚78.5148、6.312和8.910，甲睪酮70.8109、4.111和6.67.5，炔諾酮69.887.2、4.010和6.78.8，17-乙炔雌二醇67.7120、4.212和9.310，雌二醇82.8103、0.410和6.811，6-甲基-17-羥基孕酮70.399.2、2.79.3和5.97.8，苯甲酸雌二醇73.0104、5.412和9.712，乙酸氯地孕酮72.991.8、3.39.2和8.08.6。2.4 檢測限、定量限按照“1.7”求得各組分檢測限、定量限（g·

31、;kg-1），分別為：己烯雌酚0.99和3.30；甲睪酮1.05和3.50；炔諾酮1.19和3.97；17-乙炔雌二醇0.94和3.13；雌二醇1.45和4.83；6-甲基-17-羥基孕酮 1.56和5.20；苯甲酸雌二醇1.92和6.40；乙酸氯地孕酮2.41和8.03。3 討論3.1 樣品的前處理對于性激素在生物樣品中的前處理方法在20世紀90年代發展很快，早期的比較經典和被人們廣泛接受的提取純化方法是用于TLC檢測的方法17。這個方法的優點是它適用于所有的性激素類，其不足之處在于提取純化過程繁瑣（2.5 d），化學試劑用量大（一個樣品需要900 ml），且都是有毒的有機試劑。為了克服這些

32、不足之處，許多學者報道了用簡便的固相萃取（SPE）柱代替自制的層析柱的改進方法24。使用固相萃取柱已成為尿中性激素分析的基礎方法，但是盡管使用了液液提取、固相萃取或多種方法聯合，在動物組織中的藥物提取仍比較困難。有的學者提出將SPE和HPLC結合25，或是使用免疫測定固相柱。但這些方法只局限于少量的類固醇類激素11。本試驗參考Hartmann的方法17，也是采取液液萃取與固相萃取相結合方式，在一些具體方面結合后來一些學者的方法進行改進1416，力求找到一種樣品處理時間更短，使用試劑更安全，適用性更廣，靈敏度更高的前處理方法。3.2 樣品的衍生化性激素類藥物結構上都含有羥基或酯化結構，直接進行氣

33、相色譜分析時，由于羥基對色譜柱的保留，色譜峰形較差，因此有必要通過衍生化改變其色譜性能。性激素的羥基和酯化結構是其選擇衍生化的基礎，常用的衍生化試劑有硅烷化試劑（TMS）16和HFB14等，本試驗曾經試用過選用三氟乙酰胺（BSTFA）、硅烷化、酰化等幾種衍生化試劑。BSTFA的衍生化產物復雜，影響分析達不到衍生化目的，HFB衍生后表現出良好的色譜行為，因此選定HFB作衍生化試劑。HFB衍生化試劑的選擇性強，對于羥基或者酯化結構的性激素都能結合，衍生化后，EI質譜可以獲得豐富的高質量的離子質譜，且高質量的碎片離子均有較高的相對豐度，有利于生物樣品中性激素的定性定量分析。近年來報道的研究大都是采用

34、HFB衍生化試劑。另外，HFB屬于酸酐，遇水立即分解，因此在加入衍生化試劑之前將殘留物放入烘箱干燥10 min，以確保衍生化的干燥條件。3.3 特征離子的選擇質譜主要用于定性分析，要用于定量分析，可以采用選擇離子檢測法（SIM）選擇幾個特征性的離子。由于所用儀器狀態、樣品濃度、凈化程度、衍生化方法等存在差異，使得所采集到的質譜圖與譜庫中標準譜圖匹配度不高或者找不到相匹配的標準譜圖，難以進行定性分析。因此本試驗自行采集建立所選藥物標樣的全掃描質譜圖作為標準譜圖用于定性分析，進而選擇特異性的離子用以定量。含有一個羥基的性激素與HFB衍生化后形成單乙酰衍生物（甲睪酮，炔諾酮，17-乙炔雌二醇，雌二醇

35、，6-甲基-17-羥基孕酮，苯甲酸雌二醇，乙酸氯地孕酮），含有兩個羥基的性激素與HFB衍生化后形成雙乙酰衍生物（己烯雌酚）。質譜分析結果表明，在EI（+）檢測方式下，8種性激素類藥物的質譜斷裂方式存在共性，即對于含有氟的分子，在進行質譜分析時，優先脫去HF；對于含有丁酸酯的分子，在其質譜碎片中，易產生脫丁酸的特征性碎片。由于性激素大部分都含有羥基，在進行色譜分析時，均能產生脫水的碎片離子，可以利用這些特征碎片離子對性激素進行定性分析。從性激素類藥物七氟衍生物的電子轟擊質譜圖可知，其質譜裂解的主要碎片離子均具有較高的質量數和較強的豐度。通過多離子選擇離子監測，并根據這些離子的峰強度比，進一步確定

36、這8種性激素，從而應用于定量分析。3.4 方法學的評價運用本文方法提取樣品中的性激素，所得不同濃度的回收率與國外同類試驗相比較16，文獻報道的性激素在肌肉組織中的回收率范圍為26%65%，回收率較好。性激素禁止用作動物促生長添加藥物，因此其方法檢測限應越低越好。本方法靈敏度高，檢測限的范圍為0.942.41 g·kg-1，能夠檢出豬肌肉中較低濃度的性激素。與國外同類研究相比較16，該文獻報道的性激素在肌肉組織中的檢測限范圍為0.12.6 g·kg-1，存在一定的差距，原因主要有以下兩方面：一是最后定容量，國外為25 l，由于實驗室的GC-MS儀器條件要求符合自動進樣的體積，

37、本試驗最后定容為700 l；二是本實驗室GC-MS的m/z值范圍比較窄，只能選擇600以內的離子，因此，對檢測限的制定有有待進一步探討。4 結論本文建立的豬肌肉組織中性激素多組分的GC-MS檢測方法具有簡便、快速、靈敏的特點，定量限和檢測限滿足相關研究的要求，可用于豬肌肉中性激素的測定。References 1李 端. 藥理學(第5版). 北京: 人民衛生出版社, 2006: 293-307.Li D. Pharmacology (5th ed). Beijing: Peoples Medical Publishing House, 2006: 293-307. (in Chinese)2Sa

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