1、他克莫司與環孢菌素A對肝移植受者CD4/CD8 T淋巴細胞亞群及共刺激                    作者：白楊娟, 王蘭蘭, 蔡 蓓, 鄒遠高, 馮偉華, 嚴律南  【摘要】  目的: 探討他克莫司（Tacrolimus, FK506）與環孢菌素A（CsA）對肝移植受者T淋巴細胞亞群共刺激分子的調節作用。方法: 采用熒光標記單克隆抗體(mAb)結合流式細胞技術, 測定移植術后使

2、用FK506或CsA2月末的肝移植受者外周血T細胞亞群及其表面共刺激分子CD28、 CD152 和ICOS的表達情況。以健康志愿者（健康對照組）和患終末期肝臟疾病擬進行肝移植者（疾病對照組）為對照。結果: 疾病對照組T細胞亞群平衡紊亂、 共刺激分子表達異常（P<0.05）。治療組肝移植受者T淋巴細胞亞群表達恢復至健康對照水平, T細胞表面CD28和ICOS分子表達顯著降低（P<0.05）而CD152分子表達明顯升高（P<0.05）。比較不同藥物治療組: CsA治療組CD4+T細胞表達和CD8+T細胞表面CD28、 CD152分子表達均明顯高于FK506治療組（P<0.0

3、5）; 其他指標無統計學意義（P>0.05）。結論: 在常規血藥濃度條件下FK506和CsA的對CD4/CD8T細胞亞群及共刺激分子的免疫調節作用存在差異。FK506對T細胞亞群的調節作用強于CsA。FK506可同時抑制正性共刺激分子CD28和ICOS表達并促進負性共刺激分子CD152表達, 而CsA對T細胞免疫抑制作用主要是通過促進CD152分子的高表達介導。 【關鍵詞】  他克莫司; 環孢菌素A; CD28; CD152; ICOS; 肝移植    他克莫司（Tacrolimus, FK506）與環孢菌素A（Cyclosporine A, Cs

4、A）是目前國內外器官移植術后臨床應用最為普遍的免疫抑制劑。它們同屬鈣調磷酸酶抑制劑（Calcineurine inhibitor,  CNI）類藥物, 主要通過抑制T細胞活化相關細胞因子基因的轉錄激活及相應細胞因子的表達發揮免疫抑制作用。T細胞活化相關細胞因子的表達作為免疫細胞信號傳導的末期事件必然受到上游信號的影響, 而共刺激信號分子在T細胞活化和功能效應調節中扮演了重要角色, T細胞發生免疫活化或免疫耐受直接受這些信號分子的調控。盡管FK506與CsA同屬鈣調磷酸酶抑制劑類藥物, 但他們在免疫調節效應、 用藥劑量和毒性作用等方面卻具有各自的特點。因此, 我們擬通過分析FK506和

5、CsA對肝移植術后患者外周血T細胞亞群及其各亞群細胞表面共刺激分子CD28、 CD152（CTLA4）和ICOS的調節作用, 探討FK506與CsA對CD4/CD8T淋巴細胞亞群共刺激分子表達的影響。    1  對象和方法    1.1  研究對象  (1)接受CNI治療的肝移植受者（肝移植受者組）, 為2004-07/2004-12在四川大學華西肝移植中心接受同種異體肝移植的受者, 30例, 男性, 2862歲, 其中20例接受FK506抗排斥方案治療（FK506+激素+硫唑嘌啉或驍悉）, 10例接受

6、CsA抗排斥方案治療（CsA+激素+硫唑嘌啉或驍悉）。根據使用的CNI不同, 進一步分為FK506治療組和CsA治療組。于肝移植術后接受免疫抑制治療2月末采集外周血標本進行各指標測定。(2)終末期肝臟疾病患者（疾病對照組）, 為擬接受肝移植的終末期肝臟疾病患者, 20例, 男性, 年齡2960歲, 其中肝癌13例, 肝硬化4例, 重癥肝炎3例。所有患者均未使用FK506、 CsA或其他相關免疫調節藥物。(3)健康對照: 均為健康志愿者, 20例, 男性,  2050歲, 無相關疾病史, 均未使用過FK506、 CsA或其他相關免疫調節藥物。    1.2

7、  方法    1.2.1  標本采集和處理  采集EDTA抗凝外周全血標本。留取部分全血用于FK506和CsA血藥濃度檢測后, 剩余標本于采集后2 h內以Ficoll淋巴細胞分離液制備單個核細胞后標記檢測。    1.2.2  FK506血藥谷濃度測定  在ABBOTT IMX（ABBOTT公司, 美國）分析儀上使用Tacrolimus試劑盒（ABBOTT公司, 美國）以熒光偏振免疫原理測定FK506血藥谷濃度。    1.2.3  CsA血藥

8、谷濃度測定  應用高效液相色譜法（HPLC）測定CsA血藥谷濃度。    1.2.4  T細胞亞群和共刺激分子表達測定  相應熒光標記單克隆抗體(mAb)20 L與單個核細胞懸液或全血100 L進行30 min避光標記反應, 溶血后使用EPICSXL型流式細胞儀（BECKMAN COULTER公司, 美國）測定各項指標。所用的熒光標記mAb為: CD4FITC/CD8PE/CD3PECY5、 CD4PE、 CD8PE、 CD28FITC、 CD154FITC、 CD4FITC、 CD8FITC、 ICOSPE鼠抗人mAb（Immuno

9、tech公司, 法國）; IgG1FITC、 IgG1PE、 IgG2PE鼠抗人的同型對照mAb（Immunotech公司, 法國）。分別測定T淋巴細胞表達率（CD3+ %）、 CD4+T淋巴細胞表達率（CD3+CD4+%）、 CD8+T淋巴細胞表達率（CD3+CD8+%）、 CD4+T細胞/CD8+T細胞的比值 (CD4/CD8)、 CD4+CD28+細胞表達率（CD4+CD28+%）、 CD8+CD28+細胞表達率（CD8+CD28+%）、 CD4+CD152+細胞表達率（CD4+CD152+%）、 CD8+CD152+細胞表達率（CD8+CD152+%）、 CD4+ICOS+細胞表達率（

10、CD4+ICOS+%）和CD8+ICOS+細胞表達率（CD8+ICOS+%）。    1.2.5  統計學分析  采用SPSS12.0軟件對數據進行統計描述和統計分析, T細胞亞群結果以x±s表示, 組間比較采用t檢驗, 多組間比較采用方差分析; 共刺激分子的表達以中位數和四分位數間距表示, 樣本間比較采用非參數秩和檢驗。    2  結果    2.1  肝移植受者FK506和CsA血藥谷濃度  FK506治療組受者FK506平均血藥谷濃度（c

11、0）為9.0±4.4 g/L。CsA治療組受者CsA平均血藥谷濃度（c0）為185±55 g/L。    2.2  肝移植受者組受者外周血T細胞亞群  疾病對照組患者外周血CD3+百分率接近健康對照水平（P>0.05）, 但其CD4+CD3+百分率明顯高于健康對照組（P<0.05）而CD8+CD3+百分率明顯低于健康對照組（P<0.05）, CD4/CD8比值明顯高于健康對照組（P<0.05）。肝移植受者組外周血CD3+、 CD4+CD3+和CD8+CD3+百分率均恢復至健康對照水平。與疾病對照組比較

12、, 肝移植受者組受者外周血CD3+百分率稍有回升, 其CD4+CD3+百分率明顯降低而CD8+CD3+百分率明顯回升（P<0.05）, CD4/CD8比值明顯降低（P<0.05）。進一步分析不同藥物治療組T細胞亞群表達情況。FK506治療組受者外周血T細胞亞群表達與健康對照組無統計學意義; 與疾病對照組比較, CD3+百分率水平接近、 CD4+CD3+百分率明顯降低、 CD8+CD3+百分率明顯升高、 CD4/CD8比值明顯下降（P<0.05）。CsA治療組受者外周血T細胞亞群表達與健康對照組無統計學意義; 與疾病對照組比較, CD4+CD3+百分率稍有降低、 CD8+CD3

13、+百分率稍有回升（P>0.05）、 CD4/CD8比值明顯降低（P<0.05）。兩治療組比較, 雖然CD3+百分率無統計學意義, 但是CsA治療組CD4+CD3+百分率顯著高于FK506治療組（P<0.05）, 而同時其CD8+CD3+百分率則稍低于FK506治療組, 兩治療組受者CD4/CD8比值無統計學意義（表1)。表1  肝移植受者外周血T細胞亞群分析1         2.3  肝移植受者外周血T細胞表面共刺激分子表達分析    2.3.1

14、  肝移植受者外周血T細胞表面CD28分子表達  疾病對照組外周血淋巴細胞表面CD28分子表達增加, CD4+CD28+和CD8+CD28+百分率顯著高于健康對照組（P<0.05）。肝移植受者外周血CD4+CD28+百分率明顯低于疾病對照組（P<0.05）并接近健康對照組水平, 而CD8+CD28+百分率則明顯低于兩對照組水平（P<0.05）。進一步分析不同藥物組。FK506治療組受者外周血CD4+CD28+和CD8+CD28+百分率均顯著低于疾病對照組（P<0.05）, 其中CD8+CD28+百分率還明顯低于健康對照組（P0.05）。CsA治療組受

15、者外周血CD4+CD28+和CD8+CD28+百分率與疾病對照組比較均無統計學意義,  并稍高于健康對照組。兩治療組比較, CsA治療組CD8+CD28+百分率明顯高于FK506治療組（P0.05,  表2)。表2  肝移植受者外周血T細胞表面共刺激分子表達分析    2.3.2  肝移植受者外周血T細胞表面CD152分子表達  疾病對照組患者外周血CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率均明顯高于健康對照組（P0.05）。肝移植受者外周血CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率均顯著高于健康對照組

16、（P0.05）, 其中CD4+CD152+百分率還明顯高于疾病對照組（P0.05）。進一步分析不同藥物治療組。FK506治療組CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率均顯著高于健康對照組（P0.05）, 與疾病對照組比較無統計學意義。CsA治療組CD4+CD152+和CD8+CD152+百分率顯著高于健康對照組和疾病對照組（P0.05）, 同時也顯著高于肝移植受者的總體水平（P0.05）。兩治療組比較, FK506治療組CD8+CD152+百分率稍低于CsA治療組, 而其CD4+CD152+百分率則明顯低于CsA治療組（P<0.05, 表2)。   

17、 2.3.3  肝移植受者外周血T細胞表面ICOS分子表達  疾病對照組患者外周血CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率均顯著低于健康對照組（P<0.05）。肝移植受者外周血CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率均顯著低于健康對照組（P<0.05）, 與疾病對照組比較無統計學意義。進一步分析不同藥物治療組。FK506治療組受者外周血CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率明顯低于健康對照組水平（P<0.05）, 與疾病對照組比較無統計學意義。CsA治療組患者外周CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率明顯低于健康對照組水平（P<0

18、.05）, 其中CD8+ICOS+百分率還明顯低于疾病對照組（P<0.05）。兩治療組間CD4+ICOS+和CD8+ICOS+百分率無統計學意義（表2)。    3  討論    已有研究證實, 鈣調磷酸酶抑制劑FK506、 CsA主要的免疫抑制特性均為通過破壞T細胞TCR信號的傳遞, 從而抑制T細胞的特異性免疫反應1-3。對不同免疫抑制劑作用靶點的研究, 將會使我們進一步了解各種免疫抑制劑對T細胞活化和效應調節特點、 掌握它們對T細胞免疫耐的誘導調節效應, 從而更好地保證移植物的存活、 延長移植受者的生命。 

19、;   在移植免疫反應中, CD4+T細胞與移植排斥反應密切相關。已有資料表明, CD4+Th1細胞主要參與急性排斥反應, 而CD4+Th2細胞則主要參與慢性排斥反應, 而CD8+T細胞在移植排斥反應中除具有攻擊殺傷的細胞毒作用外, 同時還具有免疫調節效應。目前在免疫抑制劑的應用過程中, 移植后受者急性排斥反應發生率逐漸下降, 而慢性排斥反應一直是較難控制的問題。由此, 對T細胞活化與耐受的調節成為大家關注的重點, 而免疫抑制劑對患者淋巴細胞的調節作用就顯得尤為重要。    本研究結果顯示, 無論是疾病對照組還是移植后肝移植受者組, 其T淋巴細

20、胞總數均未發生明顯變化, 但終末期肝臟疾病患者有明顯的T細胞亞群平衡的嚴重偏移, 并以CD4+T細胞活躍亢進為主。該組患者CD4+T細胞的高表達可輔助其B細胞功能亢進, 促進體液免疫功能亢進和漿細胞活化增殖并分泌大量免疫球蛋白, 從而與終末期肝病患者血漿白蛋白/球蛋白比例倒置和密切相關。肝移植術后接受免疫抑制治療后, 鈣調磷酸酶抑制劑FK506和CsA并不影響T細胞的生成, 但T細胞亞群的失衡卻得到明顯改善, CD4+T細胞表達明顯降低、 CD8+T細胞表達回升、 CD4/CD8 T細胞比值降低, 且均恢復到正常水平。提示, FK506與CsA抑制Th細胞的功能為主。進一步分析不同免疫抑制劑組

21、的T細胞亞群表達結果時我們發現, 盡管兩治療組T細胞亞群表達均恢復到正常水平, 但FK506和CsA對T淋巴細胞亞群的調節作用存在明顯不同: FK506治療組的CD4+T細胞明顯低于CsA治療組,  CD8+T細胞水平高于CsA治療組。提示在常規血藥濃度條件下, FK506對CD4+T細胞的抑制能力及對CD8+T細胞的增強作用均明顯強于CsA。    CD28、 CD152、 ICOS（inducible  costimulator）分子同屬CD28共刺激分子家族4。 CD28與CD152是一對參與T細胞增殖活化的互為拮抗的共刺激信號分子, C

22、D28具有正向調節功能, 其對T細胞的活化有重要的加強作用; 而CD152則具有負向調節功能, 其與配體結合后可通過產生抑制性信號或與CD28競爭B7受體從而抑制T細胞活化。在CD28信號存在時, CD152還可對CD8+T細胞的活性進行抑制4-7。ICOS分子又被稱為AILM（activation inducible lymphocyte immunomordulatory molecule）, 其表達于活化的T細胞上。ICOS的配體B7h表達于靜止的B細胞、 DC細胞和單核細胞上, 其不與CD152、 CD28或PD1結合8, 9。    本研究結果還顯示, 終末期肝臟疾病患者CD4+T細胞與CD8+T細胞上的正向調節信號分子CD28和負向調節信號分子CD152的表達均明顯高于健康對照, 但維持T淋巴細胞活化效應的正向調節信號分子ICOS表達明顯低于健康對照。CD4+T細胞上CD28分子