1、原核表達系統是目前使用最廣泛、最完善的重組蛋白表達系統，具有遺傳背景清晰.表 達周期快、表達量高、成本低等優勢，缺點是無法進行蛋白的翻譯后修飾，得到具有生物活 性蛋白的幾率較小。原核表達系統適用于表達原核來源的蛋白或不需要韌譯后修飾的真核 來源蛋白。在原核蛋白表達過程中，需要綜合考慮表達菌株、質粒載體、表達條件三大因素，以獲 得最滿意的表達效果。下面為大家一一介紹這三大因素的選擇和優化。1. 表達菌株菌株的選擇往往是大家最容易忽視的，大多數人會選擇使用自己實驗室有的或用過的表達菌株。當蛋白表達效果不佳時，大多會在質粒載體或表達條件上找原因，而不會考慮菌株 的選擇是否合適。但作為表達宿主，菌株一

2、定會對外源基因表達蛋白產生影響。圖1大腸桿菌原核表達系統常用的菌株包括大腸桿菌、芽鞄桿菌和鏈霉菌。其中運用最為廣泛的就是 大腸桿菌表達系統。以下為大家列出了一些常用的大腸桿菌表達菌株，可根據不同的需求進 行選擇。常用表達菌株應用對照株，不能使用T7啟動子，蛋白酶敲除BL21BL21 (DE3)常規表達宿主菌，蛋白酶敲除BL21trxB (DE3)常規表達宿主菌，形成二硫鍵，蛋白酶敲除BL21trxB (DE3) pLysS高嚴緊表達宿主菌，形成二硫鍵，蛋白酶敲除Origami對照株，不能使用T7啟動子Origami (DE3)常規表達宿主菌，形成二硫鍵Origami (DE3) pLysS高嚴

3、緊表達宿主菌，形成二硫鍵Rosetta對照株，不能使用T7啟動子，蛋白酶菽除Rosetta (DE3)常規表達宿主菌，可控制表達水平，提供稀有密碼子tRNAs,蛋白酶敲除Rosetta (DE3) pLysS高嚴緊表達宿主菌，可控制表達水平，提供稀有密碼子tRNAs,蛋白酶敲除Rosetta-gami對照株，不能使用T7啟動子常規表達宿主菌，形成二硫鍵，提供稀有密碼子tRNAsRosetta-gami (DE3)Rosetta-gami(DE3)高嚴緊表達宿主菌，形成二硫鍵，提供稀有密碼子tRNAspLysS2. 質粒載體質粒表達載體上的重要元件包括啟動子，多克隆位點，終止子，復制子，信號肽，

4、融合 標簽，篩選標記等。根據載體上這些元件的特性，有多種質?？晒┻x擇。(4g Ml|42Q) FWtlI1W1(3 AhdtpT22bt)阿s IpIXJI： ANWNI/7iic)roiK MfMU |HQ6MMX (SIMjBC1- IX12S；BKtll “0H【l!5H:SIM1PA) B217XI2S rrri tviiiu圖2大腸桿菌表達質粒pET-22bG）圖譜啟動子：根據啟動子的強弱考慮，強啟動子可以提高蛋白表達量；弱啟動子可以降低本 底表達、增加可溶表達、表達小量伴侶蛋白等。根據啟動子的作用方式考慮，組成型啟動子 使宿主不停的表達重組蛋白；誘導型啟動子使宿主在特定誘導條件下表

5、達重組蛋白。終止子：終止子的作用在于保護mRNA在核外不被降解，延長mRM的壽命，以提高重組 蛋白表達量。對于T7系統來說，由于T7 R51A聚合酶效率非常高，保證一直有充足的mRNA 提供槪譯，所以終止子對其影響不大，只有一些自身帶有起始密碼子的外源基因需要終止子。復制子：復制子決定質粒載體拷貝數，拷貝數越高，重組蛋白表達量就越高。表達載體 通常會選用高挎貝的復制子，但過高的拷貝數會影響質粒穩定性和宿主生長。常用的高拷貝 復制子包括pCoEl, pMBI （pUC）等。融合標簽：融合標簽是與目的蛋白共同表達的一段多肽。校小的融合標簽（如His-tag） 一般不影響重組蛋白的結構和功能；較大的

6、融合標簽（如GST）可以幫助蛋白表達和折疊, 提高蛋白溶解度。N端標簽自身帶有啟動子和宿主偏好密碼子，可以提高蛋白表達量，但提 前中止的蛋白片段也會一并被純化；C端標簽則可保證只有完整的蛋白得到純化。標簽位置 還應該避免位于蛋白重要功能區末端。篩選標記：在沒有壓力的培養環境下，宿主中的外源質粒常隨著復制而丟失。為了穩定質粒表達，需要在質粒載體中加入篩選標記，使宿主在壓力環境下生長。常用的抗生素篩選 標記有：青專素抗性、卡那霉素抗性、氯霉素抗性和四環素抗性等。需要根據不同的菌株和 培養環境，選擇合適的篩選標記。3. 優化表達條件新建的重組蛋白表達系統常常會出現蛋白不表達、或表達量不理想等情況。為

7、了提高重 組蛋白表達量、改善蛋白質量，一般都需要對表達條件進行優化。原核表達條件的優化主要 從以下幾方面考慮：蛋白不表達：如果重組蛋白不表達，首先檢查cDNA和質粒長否正確，然后嘗試更換菌 株、質粒載體、標簽等。通常原核來源的蛋白不能表達的情況很少見，如果是真核蛋白不能 表達，還可以更換表達系統，嘗試酵母或昆蟲細胞表達系統。蛋白表達量低：宿主菌蛋白的密碼子使用頻率一般是不同的，有最佳密碼子、偏好密碼 子、稀有密碼子和利用率最低的密碼子。檢查目的蛋白的密碼子構成，使其適應宿主菌的密 碼子偏好。如果重組蛋白N端存在大量集中稀有密碼子，會降低mRNA的穩定性，顯著降低 翻譯速度，引起樹譯提前中止，將

8、這些稀有密碼子突變成宿主偏好的密碼子，能夠顯著提高 蛋白表達水平。另一種方法，還可以將菌株更換為提供稀有密碼子tRNAs的菌株（如Rosetta）. 此外，高GC含疑、回文結構和相距較近的兩個起始密碼子都會阻礙轉錄啟動。可溶表達低：如果重組蛋白可溶表達低，可嘗試降低誘導后培養溫度，引導重組蛋白降 低表達速度，提高正確折疊率，一般25-30-C就能明顯改善蛋白折疊。重組蛋白在所有細胞 中表達水平相當時，減少誘導劑可明顯增加蛋白可溶表達量。使用M9ZB和NZCYM培養基， 可增加細菌的拷貝數；使用LB培養基，可提高外源蛋白的表達量。高秦性蛋白：宿主菌的生長會受到外源基因表達的彫響。經過改造的宿主在很大程度上 能夠容忍重組蛋白，重組蛋白可以占到細胞總蛋白量的50%以上。但少數高毒性蛋白的本底 表達會殺傷宿主，導致質粒丟失，所以需要降低重組蛋白的本底表達量，采用的方法包括在 培養基中加入氓的葡萄糖、使用嚴格啟動和低拷貝數的載體、選擇可表達T7溶菌酶的宿主 等。除此之外，還可以通過共表達重組蛋白抑制劑、提高抗生素濃度等方法提高重組蛋白表 達量。包涵體表達：過量表達的重組蛋白會在大腸桿菌細胞內凝聚，形成無活性的