1、Survivin反義寡核苷酸誘導(dǎo)K562細(xì)胞株凋亡的實驗研究        作者：李建廠 徐酉華 賈秀紅 【摘要】 目的 探討Survivin反義寡核苷酸對K562細(xì)胞株凋亡的影響。方法 將K562細(xì)胞分為四組：反義組、無義組、脂質(zhì)體組及空白對照組，通過脂質(zhì)體將Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染入各組K562細(xì)胞，用免疫組化法測定轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞Sur             

2、0;                                    作者：李建廠 徐酉華 賈秀紅 【摘要】  目的 探討Survivin反義寡核苷酸對K562細(xì)胞株凋亡的影響。方法 將K562細(xì)胞分為四組：反義組、無義組、脂質(zhì)體組及

3、空白對照組，通過脂質(zhì)體將Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染入各組K562細(xì)胞，用免疫組化法測定轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞Survivin基因及Caspase3的表達(dá)差異，用 Tunel及Annexin VFITC測定各組細(xì)胞的凋亡率。 結(jié)果 Survivin基因在K562細(xì)胞高表達(dá)，轉(zhuǎn)染反義核苷酸后其表達(dá)下降，轉(zhuǎn)染Survivin基因反義核苷酸后Caspase3的表達(dá)較其它各組升高，K562細(xì)胞生長受抑，細(xì)胞凋亡率升高。結(jié)論 Survivin反義寡核苷酸能夠下調(diào)Survivin基因的表達(dá)，促進(jìn)白血病細(xì)胞株K562的凋亡。  【關(guān)鍵詞】  Survivin 反義寡核苷酸 K562細(xì)胞

4、 凋亡 基因治療     【Abstract】  Objective  To study the apoptosis of leukemia cells induced by antisense oligonucleotide targeting Survivin.Methods  Oligonucleotides were delivered in the form of complexes with Lipofectin. K562 cells were divided into four groups: ASON group,N

5、SON group,lipofectin group,and control group. The expression of  Survivin Caspse3 was examined by immunohistochemistry(SABC). And detected the apoptotic rate of each group with two methods:  Tunel assay and Annexin VFITC assay.Results  The protein of Survivin is overexpress in K562 ce

6、lls ,but after treated with antisense oligonucleotide, the level of expression was down regulation. After transfection, the expression of caspase3 of ASON group was upgrade contrast to other three groups（P0.05）.The apoptotic rates detected by Tunel assay and Annexin VFITC assay of ASON group were al

7、l higher than other three groups（P0.05）.Conclusion  Antisense oligonucleotide targeting Survivin can down regulate the protein expression of Survivin, and can induce K562 cells to apoptosis.     【Key  words】  Survivin,antisense oligonucleotide,  K562 cells,  a

8、poptosis,  gene therapy     Survivin是1997年發(fā)現(xiàn)的一種新的凋亡抑制基因，屬凋亡抑制蛋白家族（IAPs），定位于17q25上，廣泛地表達(dá)于胚胎發(fā)育組織以及多數(shù)人類腫瘤細(xì)胞，在正常分化成熟組織中未見表達(dá)1。Survivin基因在胚胎發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。研究表明，用反義技術(shù)下調(diào)Survivin基因的表達(dá)，能明顯抑制腫瘤細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)其凋亡，并促進(jìn)化療藥物的敏感性2。我們以脂質(zhì)體作為載體3，將Survivin反義寡核苷酸導(dǎo)入白血病細(xì)胞株K562，用多種方法檢測其凋亡指數(shù)，觀察Survivin反義寡核

9、苷酸誘導(dǎo)凋亡的作用。     1  材料與方法     1.1  主要試劑  脂質(zhì)體（Lipofectamine TM）購自美國Invitrogen公司，Survivin山羊抗人多克隆抗體及Caspase3鼠抗人單克隆抗體均由美國Santa Cruz公司提供，Tunel原位凋亡試劑盒由德國Roche公司提供，Annexin VFITC凋亡檢測試劑盒由晶美生物工程有限公司提供。     1.2  寡核苷酸  Survivin反義寡核苷酸（5CCCAGCCTT

10、CCAGCTCCTTG3）及無義寡核苷酸（5GCCATGGCTACCTTAGCGTT3）均由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，兩端各5個堿基硫代磷酸化修飾。     1.3  細(xì)胞培養(yǎng)  白血病細(xì)胞株K562由重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院外科研究室保存，DMEM F12細(xì)胞培養(yǎng)基及胎牛血清均購自Hyclone 公司。K562細(xì)胞置37、5CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。     1.4  實驗分組  分4組，反義寡核苷酸組（反義組）：反義寡核苷酸脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液；無義寡核苷酸組（無義組）：無義寡核苷酸脂質(zhì)體

11、轉(zhuǎn)染液；脂質(zhì)體組：脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染液；空白組對照組（空白組）：等體積的轉(zhuǎn)染液。     1.5  轉(zhuǎn)染  取對數(shù)生長期的細(xì)胞，用不含抗生素及血清的DMEM培養(yǎng)液制成單細(xì)胞懸液，接種細(xì)胞懸液至6孔板，細(xì)胞數(shù)為3×105/孔，反義組及無義組加入寡核苷酸與脂質(zhì)體稀釋后的混合液中，反義寡核苷酸終濃度為0.555 nmol/ml，無義寡核苷酸終濃度為0.544 nmol/ml；脂質(zhì)體組只加入相同劑量的脂質(zhì)體；空白組只加入同體積的培養(yǎng)液，置37 CO2孵箱中培養(yǎng)6 h，培養(yǎng)之后，在不去除轉(zhuǎn)染培養(yǎng)液的情況下，每孔加胎牛血清，使血清終濃度為10，放入CO2

12、孵箱中繼續(xù)培養(yǎng)。     1.6  免疫組化法測定轉(zhuǎn)染前后Survivin基因及Caspase3的表達(dá)  分別將轉(zhuǎn)染后的4組細(xì)胞吹打離心，制成單細(xì)胞懸液，均勻涂在玻片中心，室溫下涼干。冷丙酮室溫下固定15 min，3%H2O2溶液中室溫下浸泡30 min，以充分滅活內(nèi)源性過氧化物酶； 滴加封閉血清，置室溫下20 min，甩去多余液體； 滴加相應(yīng)一抗20 l，4過夜；加生物素化二抗20 l，37 20 min，滴加SABC試劑，37 20 min，PBS沖洗， DAB顯色，顯微鏡下觀察。同時PBS代替一抗做陰性對照。   &#

13、160; 陽性結(jié)果判斷（采用染色強(qiáng)度及陽性細(xì)胞數(shù)進(jìn)行評分）：染色強(qiáng)度分四級：陰性(0分)、淡黃色(1分)、黃色(2分)、棕黃色(3分)；陽性細(xì)胞數(shù)分五級：5%(0分)、6%25%(1分)、26%50%(2分)、50%75%(3分)、75%(4分)；隨機(jī)計數(shù)5個視野，每個視野計數(shù)200個細(xì)胞，計算陽性細(xì)胞率。兩者的乘積作為最終的結(jié)果判斷：0分（）、14分（+）、58分（+）、912分（+），評分越高說明陽性程度越高。     1.7  Tunel法檢測細(xì)胞凋亡率4  將4組細(xì)胞制備單細(xì)胞懸液，涂片，4%的多聚甲醛（用0.01 M PBS配制）在1

14、525條件下固定60 min，用含3%H2O2的甲醇溶液孵育10 min，在冰上（28）用透化液（含0.1% Triton X100 的0.1%枸櫞酸鈉溶液）透化處理2 min，每份標(biāo)本加20 l的Tunel反應(yīng)混合液（酶溶液與標(biāo)記液以19混合），37避光孵育60 min，每份標(biāo)本加20 l CoverterPOD，37孵育30 min，PBS沖洗3次，每次3 min，滴加顯色劑顯色。     1.8 Annexin VFITC檢測法4 用去離子水按14稀釋結(jié)合緩沖液（4 ml結(jié)合緩沖液 + 12 ml去離子水）；0.01M PBS充分洗細(xì)胞，每組取總數(shù)

15、約1×105細(xì)胞待測；用250 l結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞；取195 l細(xì)胞懸液加                1.8  Annexin VFITC檢測法4  用去離子水按14稀釋結(jié)合緩沖液（4 ml結(jié)合緩沖液 + 12 ml去離子水）；0.01M PBS充分洗細(xì)胞，每組取總數(shù)約1×105細(xì)胞待測；用250 l結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞；取195 l細(xì)胞懸液加入5 l Annexin VFITC；混勻后室溫下避

16、光孵育10 min；取190 l結(jié)合緩沖液洗細(xì)胞1次；用190 l結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞；加入10 l 20 g/ml的碘化丙錠溶液（終濃度為1 g/ml）；上流式細(xì)胞儀檢測分析。     1.9  統(tǒng)計學(xué)處理  數(shù)據(jù)用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，以P0.05為顯著性標(biāo)準(zhǔn)。Tunel及Annexin VFITC檢測的細(xì)胞凋亡率以x±s表示，Survivin及Caspase3陽性表達(dá)強(qiáng)度的變化采用秩和檢驗（KruskalWallis TEST）進(jìn)行分析。     2  結(jié)果  &#

17、160;  2.1  轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞survivin基因的表達(dá)  Survivin蛋白表達(dá)在K562細(xì)胞的胞漿或（和）胞核，陽性細(xì)胞可見胞漿或（和）胞核被染成黃色或棕黃色。K562細(xì)胞中Survivin蛋白呈高表達(dá)。轉(zhuǎn)染反義寡核苷酸后K562細(xì)胞的Survivin 表達(dá)下降，而其他三組未見明顯變化。結(jié)合染色強(qiáng)度進(jìn)行綜合評價（見表1）。表1  Survivin蛋白表達(dá)檢測結(jié)果組別注：反義組48 h與其他三組比較P0.05，n=20     2.2  轉(zhuǎn)染前后K562細(xì)胞Caspase3的表達(dá)  顯微鏡

18、下觀察，Caspase3陽性細(xì)胞的胞漿被染成棕黃色，反義組24 h Caspase3的陽性程度明顯高于其他三組，與其它三組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），無義組、脂質(zhì)體組、空白組之間兩兩比較均無統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05）。轉(zhuǎn)染48 h后，反義組Caspase3表達(dá)強(qiáng)度繼續(xù)升高，與其它三組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），與反義組24 h比較P0.05，有統(tǒng)計學(xué)意義（見表2）。表2  Caspase3蛋白表達(dá)檢測結(jié)果組別注：反義組與其他三組比較P0.05，n=20    2.3  Tunel實驗結(jié)果  顯微鏡下觀察，Tunel陽性細(xì)胞

19、的胞核被染成棕黃色，反義組24、48 h Tunel的陽性率為22、32，均明顯高于同時間其他三組，與其它各組間兩兩比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），反義組48 h比24 h陽性率升高（P0.05），有統(tǒng)計學(xué)意義。無義組、脂質(zhì)體組、空白組之間兩兩比較P0.05，無統(tǒng)計學(xué)意義（見表3）。 表3  Tunel檢測結(jié)果組別  注：反義組與其他三組比較P0.05，n=5      2.4  Annexin VFITC檢測結(jié)果  經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，反義組24 h K562細(xì)胞的凋亡率為19.80%，明顯高于其他各組，與其它各

20、組間比較均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），無義組、脂質(zhì)體組、空白對照組之間兩兩比較P0.05，均無統(tǒng)計學(xué)意義，見表4。表4  流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果組別 注：反義組與其他三組比較P0.05，n=3     3  討論     腫瘤不僅存在細(xì)胞增生過度，還有細(xì)胞凋亡過低，是一種細(xì)胞增生和凋亡平衡失調(diào)的綜合性結(jié)果5。若細(xì)胞凋亡受阻就可使細(xì)胞永生化而惡變，凋亡受阻在白血病的發(fā)生發(fā)展過程中起著極其重要的作用。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)白血病細(xì)胞均不同程度的存在抗凋亡基因的高表達(dá)。     Survivin屬凋亡抑制蛋

21、白家族（IAPs），Survivin蛋白以細(xì)胞周期依賴特異性表達(dá)于G2/M期，參與有絲分裂過程中紡錘體的形成，保持有絲分裂的真實性，從而使細(xì)胞順利通過G2/M期6。Survivin基因在胚胎發(fā)育及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要的作用。對IAPs凋亡抑制作用的機(jī)制研究表明，IAPs主要通過抑制半胱天冬蛋白酶(Caspase)家族成員介導(dǎo)的蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)過程中位于下游的效應(yīng)Caspase活性發(fā)揮作用。Survivin是腫瘤基因治療的理想靶點7。Survivin可部分抑制Bax和Fas誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，保護(hù)細(xì)胞免受procaspase3、procaspase7過表達(dá)誘導(dǎo)的凋亡，抑制這些酶原活化的進(jìn)程；還

22、可以誘導(dǎo)腫瘤壞死因子受體介導(dǎo)的NF活化，從而發(fā)揮其抗凋亡作用8。Survivin抗凋亡機(jī)制較復(fù)雜，目前尚不完全清楚，有待進(jìn)一步研究。     通過反義技術(shù)來封閉凋亡抑制基因的表達(dá)是腫瘤治療的新思路、新策略。O1ie等針對Survivin mRNA設(shè)計出6條反義寡核苷酸，然后應(yīng)用熒光定量PCR篩選到下調(diào)mRNA作用最強(qiáng)的ASODN4003。用此序列的反義寡核苷酸作用于肺癌細(xì)胞系，用實時定量PCR法檢測發(fā)現(xiàn)， 轉(zhuǎn)染20 h后Survivin mRNA含量下降702。     本研究中采用此序列，通過陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)的方式轉(zhuǎn)染入K562細(xì)胞

23、。經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)，Survivin基因在白血病細(xì)胞株K562中呈高表達(dá)。將Survivin反義寡核苷酸轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后，24 h后K562細(xì)胞的Survivin蛋白表達(dá)開始出現(xiàn)下降趨勢，48 h后Survivin蛋白表達(dá)明顯下降，這說明反義寡核苷酸能夠部分阻斷Survivin基因的表達(dá)，為以Survivin反義寡核苷酸治療白血病提供了可能。     半胱天冬蛋白酶（Caspase）家族在介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的過程中起著極其重要的作用，其中Caspase3處于各種凋亡傳導(dǎo)途徑的共同下游，它在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮重要作用，是凋亡的關(guān)鍵執(zhí)行分子。本實驗研究發(fā)現(xiàn)，Survivin反義

24、寡核苷酸轉(zhuǎn)染K562細(xì)胞后Caspase3蛋白表達(dá)升高，這表明Survivin基因在K562細(xì)胞中，對Caspase3的表達(dá)起著抑制作用。由此，我們考慮Survivin反義寡核苷酸之所以能夠促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡可能與上調(diào)Caspase3的表達(dá)有關(guān)。     Tunel及Annexin VFITC 均是檢測細(xì)胞凋亡的常用方法。我們運(yùn)用這兩種方法檢測發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染Survivin反義寡核苷酸后K562細(xì)胞凋亡率較其他對照組細(xì)胞凋亡明顯增加，這說明Survivin反義寡核苷酸能夠促進(jìn)K562細(xì)胞凋亡，對白血病細(xì)胞有一定的作用。   【參考文獻(xiàn)】   1

25、Ambrosini G, Adida C,Altieri DC.A novel antiapoptosis gene, survivin, expressed in cancer and lymphomaJ. Nat Med,1997,3(8):917921. 2 Olie RA, SimoesWust AP, Baumann B,et al.A novel antisense oligonucleotide targeting survivin expression induces apoptosis and sensitizes lung cancer cells to chemotherapyJ. Cancer Res, 2000,60(11):28052809. 3 Kawaura C,Noguchi A,Furuno T,et al.Atomic fore microscopy for