1、mineral density and bone histomorphometry in rodents J . Arterio-scler Thromb Vasc Biol ,2001, 21(10 :1636-1641. 5Bjarnason NH , Riis BJ , Christiansen C. The effect of fluvastatin onparameters of bone remodeling J . Osteoporos Int , 2001, 12(5 :380-384.6Chan KA , Andrade SE , Boles M , et al. Inhib

2、itors of hydroxymethyl-glutaryl coenzyme A reductase and risk of fracture among older women J . Lancet , 2000, 355(9222 :2185-2188.7Meier CR , Schlienger RG , Kraenzlin ME , et al. HMG-CoA reduc-tase inhibitors and the risk of fracturesJ . JAMA , 2000, 283(24 :3205-3210.8Reid IR , Hague W , Emberson

3、 J , et al. Effect of pravastatin on fre-guency of fracture in the LIPID study :Secondary analysis of a ran-domised controlled trial. Long-term intervention with pravastatin in ischaemic diseaseJ . Lancet , 2001, 357(9255 :509-512. 9Whitfield JF. Statins :New drugs for treating osteoporosis J ? Ex-p

4、ert Opin Investig Drugs , 2001, 10(3 :409-415.10張勝利, 王金平 . 骨質疏松骨折愈合過程中 TGF-! mRNA 的基因表達 J . 第四軍醫大學學報, 2001, 22(6 :497-500.編輯 井曉梅研究簡報 文章編號:1000-2790(2006 03-0286-02CK20單克隆抗體的制備及鑒定劉彥慧 1, 羅春麗 2, 吳小候 3, 蔡曉鐘 2 (1中山大學東華醫院檢驗科, 廣東 東莞 523110, 重慶醫科大學:2檢驗系, 3附屬一院泌尿外科, 重慶 400016 收稿日期:2005-03-23; 接受日期:2005-05-21

5、基金項目:重慶醫學科研項目 (03-2-078通訊作者:羅春麗 . Tel :(023 68485223Email :Luochunli79hotmail. com作者簡介:劉 彥 慧 . 碩 士, 主 管 檢 驗 醫 師 . Tel :(0769 2333333Ext :30338 Email :liuliang71215163. com【關鍵詞】抗 CK20單克隆抗體; SPA-Sepharose ; 雜交瘤技術;Western Blot ; ELISA【中圖號】 R737 【文獻標識碼】 A0 引言 研究 CK20表達用于診斷和評估膀胱腫瘤, 已成為 國內外研究熱點之一 . 但目前國內的

6、抗 CK20mAb 一直依賴 進口, 價格昂貴且不便運輸, 嚴重影響其推廣應用和研究 . 我 們于 2002年 成 功 地 從 膀 胱 癌 T24細 胞 系 中 提 取 CK20抗 原 1, 我 們 采 用 CK20抗 原 通 過 雜 交 瘤 技 術 制 備 抗 CK20mAb , 為進一步研制 CK20mAb 膠體金試劑盒篩查膀胱癌奠 定基礎 . 1 材料和方法1. 1 材料 " 動物及試劑 BALB /c 小鼠購自第三軍醫大學 動物中心, 鼠齡 612wk , 體質量 1822g , 雌雄不限; CK20抗原為本實驗室純化所得; Freund 氏完全佐劑和不完全佐劑 及 HAT

7、培養基為 Gibco 產品; SP2/0骨髓瘤細胞來自中國預 防醫學科學院病毒研究所; 細胞融合劑 PEG4000為 Mereck 產 品, SPA-Sepharose CL-4B 為 Pharmacia 產品; IgA , IgM , IgG 1, IgG 2a , IgG 2b 及 IgG 3蛋白均為 Sigma 產品 . #儀器 國產 96孔 和 24孔培養板、 超凈工作臺; 德國 Heraeus 離心機, Bio-Rad 公 司 550酶標儀、 電泳儀、 轉膜系統及凝膠成像分析系統; 德國 LKB 層析系統; Olympus 倒置顯微鏡 . 1. 2 方法1. 2. 1 動物免疫及脾細

8、胞收集 免疫方法參照文獻 2, 共 免疫 3只小鼠, 免疫后用瓊脂擴散法檢測小鼠血清產生抗體 情況, 選高效價者剪頸放血取脾, 收集脾細胞, 并作 100g /L 臺盼藍染色, 同時收集血液, 分離血清供測定抗體滴度用 .1. 2. 2 細胞融合及雜交瘤細胞選擇性培養 參照文獻 2進 行, 以 HAT 為培養液, 滴加到已鋪有飼養細胞 96孔培養板 中, 置 50mL /L CO 2培養箱中培養 .1. 2. 3 陽性克隆篩選及克隆化培養 以 CK20抗原包被酶標 板微孔, 采用間接 ELLSA 法檢測所有生長孔的培養上清液, 并分別以小鼠多抗血清和 PBS 做陽性和陰性對照, 經酶標儀 測定

9、 ! 490nm 值, 以等于或大于對照 2. 1倍為陽性 . 陽性孔采用 有限稀釋法進行細胞克隆化 . 克隆化培養 1wk 后采用 ELISA 法檢測有細胞克隆化生長的所有孔上清液, 陽性者及時部分 凍存, 部分擴大培養 . 待克隆長至孔底面積的 1/32/1時, 轉 至 24孔擴大培養 .1. 2. 4 雜交瘤細胞核型分析 方法同外周血淋巴細胞染色體制作 3, 最后于油鏡下計數 20個分散較好且完整的中期分裂相 .1. 2. 5 腹水抗體的制備及抗體含量測定 共選擇 10只體健 BALB /C 小鼠, 每只腹腔接種醫用石蠟油 0. 5mL , 12d 后每只 腹腔接種 6X 106個已克隆

10、化細胞 (約 0. 5mL . 2wk 后有明 顯腹水產生時剪頸處死, 分別收集血液和腹水, 1000r X 10min , 取上清, -20C 保存 . 并采用 Bradford assay 法測定抗體 含量 .1. 2. 6 mAb 純 化 采 用 本 實 驗 室 建 立 的 方 法 純 化 CK20mAb 4.1. 2. 7 mAb 特性分析 " mAb 特異性鑒定 用 Western Blot 法, 以純化所得 CK20mAb 作一抗與體外培養的膀胱腫瘤 T24細胞行免疫印記試驗, 并以 CK20抗原做對照 . 將培養細胞裂 解, 離心, 取上清用于 SDS-PAGE 電泳,

11、 轉膜后加 CK20mAb 反 應, 顯色, 凝膠成像分析系統分析 . #mAb Ig 類型及亞型鑒定 采用雙向瓊脂免疫擴散法 5, 將雜交瘤細胞培養上清液離心并濃縮 1020倍, 加樣于 20g /L 瓊脂中, 分別加標準 IgG , IgG 1, IgG 2a , IgG 2b , IgA 和 IgM 進行雙向免疫擴散, 將加樣后瓊 脂板放入濕盒, 置 37C 水浴箱中 24h 后觀察結果 . $抗體效 價檢測 采用間接 ELISA 法, 同時測定細胞培養上清液, 免疫 小鼠血清多抗, 腹水 mAb 和純化 mAb 效價 .2 結果 通過測定被免疫小鼠的尾血發現, 3只小鼠血清與 CK20

12、抗原均在瓊脂管中相互擴散而形成一條抗原抗體結合線 . 最后一次免疫 72h 后,剪頸放血取脾, 收集脾細胞, 共獲 5X 106脾細胞, 臺盼藍染色后不著色細胞約占 97%.細胞融合后接種于 2塊 96孔培養板中,共接種 192孔, 第 15日時可 見 40孔有細胞生長, 占 20%.ELISA 測定結果發現有 8個陽 性孔, 占生長孔的 20%.取陽性克隆孔細胞株采用有限稀釋682第四軍醫大學學報 (J Fourth Mil Med Univ 2006; 27(3 http :/journal. fmmu. edu. cn法進 行 4次 克 隆 化, 每 次 接 種 60孔, 其 中 有 一

13、 株 細 胞 (CK206 隨著克隆次數增多, 抗體陽性細胞生長孔從 66%增至 100%(表 1 , 選定細胞形態較好的細胞生長孔進行擴大培 養和凍存, 并命名為 L20031030.小鼠脾臟淋巴細胞染色體眾數為 40,SP2/0為 6268, 故 雜交瘤細胞標記染色體眾數應為 99108, 本分析結果可見染 色體眾數為 99103, 說明 CK206細胞株是脾細胞和骨髓瘤 細胞的融合體 (圖 1. 表 1 雜交瘤細胞株克隆化結果! (% 細胞株 克隆次數接種孔數 細胞生長孔數抗體陽性孔數CK2061606(10 4(66 26022(37 22(100 36028(46 19(70 460

14、10(25100(100 圖 1 雜交瘤細胞染色體分析 X 10010只小鼠接種克隆細胞 2wk 后可見有不同程度腹水產 生, 共收集 50mL 腹水, 呈血性, 離心后取上清液于 -20C 保 存, Bradford assay 法測得抗體濃度為 2. 6g /L.Western BIot 結果顯示, 純化的 CK20抗原及 T24細胞裂解液 均和 CK206mab 反應, 在 " r 為 45. 0X 103附近顯示出一條很濃 的免疫印記帶 . 說明 CK206mab 具有較高的特異性 (圖 2 .a :SDS-PaGE :M :marker ; 1:純化的 CK20蛋白; 2:

15、T24細胞系裂解 液 . B :Western BIot :1. 純化 CK20抗原與 CK20mab 雜交帶; 2. T24細胞系裂解液與 CK20mab 雜交帶 .圖 2 研制所得 CK20mab 免疫印記分析雙向瓊脂擴散結果發現, CK206mab 只與 IgG 和 IgG 1之 間形成一條沉淀線, 故說明 CK20mab 屬 IgG 1亞型 .三種成分的抗體效價分別是:培養上清液效價為 11102, 血清多抗效價為 11103, 腹水 mab 和純化 mab 效價均為 11106; 三個不同 pH 的 0. 1moI /L 枸櫞酸洗脫時,分別收集 20mL ; 雙 向瓊脂擴散法鑒定證實

16、 pH 6. 0洗脫液為 IgG 1; Bradford assay 法測定抗體濃度為 1. 44g /L.!" 討論 " 膀胱腫瘤的診斷在臨床上主要依靠膀胱鏡加活檢, 其損傷性較大, 患者難以接受 . CK20在膀胱腫瘤細胞中具有獨特的表達特性 6, 利用 mab 可以通過免疫學法監測 CK20表達來評價膀胱腫瘤, 其特異性高, 方法簡單, 結果較可靠 . 我們于 2002年純化獲得了 CK20抗原, 并進行了鑒定 . 雜交瘤 技術是制備 mab 傳統而成熟方法, 又不斷得到改進 . 我們根 據本實驗室經驗和條件, 結合試驗具體情況對各個環節加以 優化, 如免疫劑量、 方

17、法和時間等, 三只小鼠免疫后均產生了 較強的抗體滴度, 證實免疫是成功的 .細胞融合后要對融合效果進行鑒定, 一般采用染色體分 析 . 本次分析結果可見雜交瘤標記染色體 (眾數為 99103 , 說明 CK206細胞株是脾細胞和骨髓瘤細胞的融合體 .mab 的純化方法較多, 但最有效的方法尚屬親和色譜法, 其方法效果好, 回收率高達 90%以上 . 本研究我們利用 SPa 和 Sepharose 交聯制成親和層析柱, 以不同的 0. 1moI /L 枸椽 酸緩沖液為流動相, 通過改變流動相 pH 值可將不同類型抗 體逐級洗脫下來, 如 pH 6. 0洗脫 IgG 1, pH 4. 0洗脫 Ig

18、G 2a , pH 3. 0洗脫 IgG 2b 等, 從對三組洗脫峰的鑒定來看, pH 6. 0時所 洗脫下來的抗體確是 IgG 1. 抗體純化后要進行活性鑒定, 從免疫印記結果看 " r 為 45. 0X 103附近出現一條很濃的抗原 抗體雜交帶, 證明了 CK206mab 具有很強的特異性和活性 . (本課題在重慶醫科大學檢驗系分子生物學實驗室完成 【參考文獻】1劉彥慧, 羅春麗, 吳小候, 等 . 膀胱腫瘤 T-24細胞系中 CK20純化及鑒定 J . 第三軍醫大學學報, 2005, 27(4 :302-305. 2王永杰, 齊 名, 李保仝, 等 . 抗克論特羅單克隆抗體雜交瘤的建立及其分泌單抗的免疫學特性鑒定 J . 免 疫 學 雜 志, 2004, 20(3 :194-198.3許 艇, 邵曉龍, 秦治翔, 等 . 殺蟲劑西維因單克隆抗體的研制及鑒定 J . 免疫學雜志, 2004, 20(1 :61-64.4劉彥慧, 羅春麗, 吳小候, 等 . 細胞角蛋白單克隆抗