1、重組疫苗E.coli LLO/OVA經TLR4和NOD1受體誘導樹突狀細胞表達細胞因子         11-01-30 09:30:00     作者：徐曼, 戴明燊, 米    編輯：studa20【摘要】  目的: 探討樹突狀細胞(DC)的模式識別受體(PPRs)活化與細胞因子表達的關系。方法: 采用基因芯片及RTPCR檢測經E.coli LLO/OVA刺激后小鼠骨髓樹突狀細胞（bone marrowderived de

2、ndritic cell, BMDC）的PPRs及其下游NFB信號通路相關分子mRNA的表達水平, 并觀察BMDC的活化狀況及培養上清液內細胞因子含量。結果: 經E.coli LLO/OVA刺激后2 h, BMDC出現短暫的TLR4 mRNA 表達上調, 其下游信號途徑相關的Myd88、 Rip2、 Irak1、 Irak2、 Ikk、 NFB1和NFB2 mRNA均出現表達上調, 黏附分子Icam1、 細胞因子IL1a、 IL1b、 IL6和TNF的mRNA也表達上調; 經E.coli LLO/OVA刺激后4 h, BMDC出現Card4(NOD1) mRNA表達上調, 其下游信號途徑相關的

3、Rip2、 Ikk、 NFB1和NFB2 mRNA均出現表達上調, IFN、 TNF和CD40 mRNA也上調表達。經E.coli LLO/OVA刺激后24 h, BMDC表達共刺激分子及MHCII類分子上調; 且培養上清液內IL12和IFN含量增高。結論: 重組疫苗E.coli LLO/OVA經TLR4和NOD1受體激活NFB信號通路, 誘導了小鼠BMDC成熟并表達一系列細胞因子尤其是IL12和IFN。 【關鍵詞】  骨髓樹突狀細胞; 重組大腸桿菌; 模式識別受體; 基因芯片Abstract  AIM:  To investigate the relations

4、hip between the activation of pattern recognition receptors and the cytokines expression of dendritic cells. METHODS:  After bone marrowderived dendritic cells (BMDCs) were  pulsed by E.coli LLO/OVA,  the mRNA expression of pattern recognition receptors and the downstream NFB signal p

5、athway associated molecules were detected by microarray hybridization and RTPCR;  the expression of costimulatory molecules,  MHC class and cytokines were determined by flow cytometry and ELISA.  RESULTS:  After BMDCs were  pulsed by E.coli LLO/OVA for 2 h,  the levels

6、of TLR4,  Myd88,  Rip2,  Irak1,  Irak2,  Ikk,  NFB1 and NFB2  mRNA upregulated;  and the levels  of Icam1,  IL1a,  IL1b,  IL6 and TNF mRNA upregulated also;  after BMDCs  were pulsed by E.coli LLO/OVA for 4 h,  the levels

7、0; of Card4(Nod1),    Rip2,  Ikk,  NFB1 and NFB2  mRNA upregulated, meanwhile,  the levels  of TNF,  TNF and CD40 mRNA upregulated. The expressions of costimulatory molecules and MHC class of the BMDCs upregulated and the concentration of IL12 and IFN inc

8、reased in the supernatant of BMDCs pulsed by E.coli LLO/OVA at 24 h.  CONCLUSION: Recombinant E.coli LLO/OVA induces   maturation and expression of  cytokines,  especially  IL12 and IFN,  of murine BMDCs through activation of   NFB signal pathway with TLR

9、4 and NOD1 receptors.Keywordsbone marrowderived dendritic cell (BMDC);  recombinant E.coli;  pattern recognition receptors (PPRs);  microarray樹突狀細胞（dendritic cells,  DC）在誘導和調節機體的獲得性免疫和天然免疫中發揮了重要作用, 因此腫瘤疫苗能否有效的活化DC是決定疫苗免疫效果的關鍵。DC能通過其模式識別受體（pattern recognition receptors,  PPRs

10、）識別病原相關模式分子而活化成熟, 從而誘導天然免疫和調節獲得性免疫。Toll樣受體（tolllike receptors,  TLR）是最主要的PPR,  目前已發現TLR1TLR13的13個TLR家族成員, 它們多分布于細胞膜, 且每一成員識別特有的模式分子, 如TLR2識別革蘭氏陽性菌的糖肽, 而TLR4識別革蘭氏陰性菌菌壁的脂多糖（lipopolysaccharide,  LPS）。TLR家族可通過依賴Myd88的信號途徑活化NFB介導MHC類分子和共刺激分子表達, 同時也促進炎性細胞因子的分泌, 此外文獻還報道TLR4的活化介導了抗腫瘤免疫1, 

11、; 2。近年來研究發現細胞內的PPR核苷酸連接的寡聚化域（nucleotidebinding oligomerization domain,  NOD）受體, 如NOD1和NOD2受體在識別細胞質內的分子后, 也能經NFB信號途徑誘導DC產生細胞因子從而啟動天然免疫, 并與TLR信號途徑協同誘導Th1細胞的產生3,  4。我們采用非致病性大腸桿菌攜帶模型腫瘤抗原卵白蛋白（ovalbumin,  OVA）和李斯特溶素O（Listeriolysin O,  LLO) 構建的重組疫苗E.coli LLO/OVA體外刺激DC, 用基因芯片雜交和RTPCR等方法檢

12、測E.coli LLO/OVA刺激DC TLR和NOD受體及其下游NFB信號途徑相關分子活化與細胞因子表達的關系。1  材料和方法1.1  材料  TRIzol RNA提取試劑和瓊脂糖購自Invitrogen公司。Rneasy迷你柱購自Qiagen公司。Taq Man逆轉錄試劑盒購自Roche公司。去內毒素的PBS buffer,  RPMI1640由Cancer research UK提供。重組鼠GMCSF購自Pepritech公司。TrulabelingAMPTM Linear RNA擴增試劑盒、 Oligo GEArray鼠NFB 信號通路基因芯片

13、購自Supperarray公司。PCR引物由Sigma公司合成。FITC連接的抗鼠CD40,  CD80,  CD86 和 IAb(MHCII)熒光抗體購自BD Pharmingen公司。鼠IL12和IFN ELISA試劑盒購自BD Biosciences公司。 68周齡雌性C57BL/6小鼠, 體質量2025 g,  購自英國Harlan公司, 于無菌環境飼養。實驗前處死小鼠取其股骨和脛骨骨髓細胞, 培養于RPMI1640培養液（含10 mL/L小牛血清,  重組小鼠GMCSF 6 ng/L）。培養第4天棄去懸浮細胞并更換培養液, 繼續培養至第7天,&

14、#160; 收集懸浮的BMDC用于實驗。1.2  方法1.2.1  細菌菌株及培養  單克隆含LLO和OVA基因片段質粒的重組E.coli LLO/OVA, 僅含OVA基因片段質粒的重組E.coli OVA經含選擇性抗生素的LB液體培養基37搖床培養過夜后, 加入4 mmol/L 的IPTG誘導LLO和OVA的合成, 當培養液A600達到1時收集細菌, 經Western blot驗證LLO和/或OVA的表達后, 分裝儲存于-80備用。E.coli LLO/OVA和E.coli OVA用前均用5 g/L多聚甲醛室溫固定30 min, 經去內毒素的PBS 洗3次后,

15、重懸為1012細菌/L, 4冰箱儲存備用。1.2.2  BMDC的培養和細菌刺激  將前述的小鼠BMDC（2×109/L）與E.coli LLO/OVA （1011/L）或E.coli OVA(1011/L)按BMDC細菌15的比例混合, 于培養管內用RPMI培養液（加入100 mL/L小牛血清）37, 50 mL/L CO2孵育60 min; 加入慶大霉素50 mg/L殺滅細胞外細菌, 洗滌并重懸細胞于RPMI培養液（加入100 mL/L小牛血清和慶大霉素50 mg/L）繼續培養; 分別于2、 4、 6、 8 h后收集細胞用于提取RNA, 24 h后收集細胞及上

16、清用于流式細胞術和ELISA檢測。1.2.3  Supperarray探針的合成和雜交  BMDC的總RNA (3 g)經逆轉錄后, 按Supperarray公司的Oligo GEArray TrulabelingAMPTM Linear RNA擴增試劑盒說明書合成生物素標記的cRNA探針。 6 g的cRNA探針與鼠NFB 信號通路基因芯片在雜交爐內60雜交18 h, 經Buffer I 和Buffer II洗滌后, 加入Solution G于雜交爐內37孵育40 min, 再加入APSA Buffer孵育10 min, CDPStar孵育5 min后取出芯片, 在暗盒內用

17、KODAK膠片覆蓋芯片曝光1015 min并沖洗膠片; 掃描儀掃描曝光后的膠片,  所得圖片經Superarray 公司GEArray expression 分析軟件分析雜交結果。1.2.4  RTPCR  分別將經E.coli LLO/OVA和E.coli OVA刺激后2, 4, 6, 8 h的BMDC提取的2 g總RNA,  用Taq Man逆轉錄試劑于42,  50 min合成cDNA后, 用PCR 50 L擴增體系擴增Tlr4和Nod1(Card4)的cDNA。RTPCR中所用引物如下: Tlr4(439 bp)F5GGAAGGACTA

18、TGTGATGTGACC3, R 5GCTCTTCTAGACCCATGAAATTGG3; Card4/Nod1 (469 bp) F 5CTTGCATTCAATGGCATCTC3, R 5ACATCGGTGTGCACTGTGGA3; Gapdh (496 bp) F 5TGATGGGTGTGAACCACGAG3, R 5TCAGTGTAGCCCAAGATGCC3。反應體系擴增條件如下: 于94變性5 min后, 94變性45 s、 55復性45 s、 72延伸45 s共30個循環, 最后72再延伸10 min。于12 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增條帶。1.2.5  細胞因子檢測

19、60; 按試劑盒操作說明向測定板孔內分別加入50 L IL12或 IFN標準、 控制液和BMDC培養上清液, 于室溫孵育2 h并用Buffer洗滌5次后, 加入100 L連接反應液于室溫孵育2 h并洗滌5次后, 加入顯色反應液室溫避光孵育30 min; 終止反應后在酶標儀上測定A450值。1.2.6  細胞表面分子檢測  分別收集E.coli LLO/OVA或E.coli OVA刺激24 h后的BMDC, 將細胞密度調整為1×105細胞/80 L , 分別加入FITC連接的抗CD40、  CD80、 CD86和MHCII (IAb)抗體, 4避光孵育30

20、 min; FACS Buffer 洗3次后重懸細胞進行流式細胞術檢測。1.2.7  統計學分析  采用SAS8.0 軟件students  t test進行統計學分析,  P<0.05具有統計學意義。2  結果2.1  重組疫苗E.coli LLO/OVA經TLR4和Card4（NOD1）活化BMDC  小鼠NFB基因芯片雜交結果顯示經E.coli LLO/OVA刺激后2 h,  BMDC出現短暫的TLR4 mRNA表達上調, 其下游信號途徑相關的Myd88、 Rip2、 Irak1、 Irak2、 Ikk

21、、 NFB1和NFB2 mRNA均出現表達上調, 黏附分子Icam1、 細胞因子IL1a、 IL1b、 IL6和TNF的mRNA也出現表達上調; 經E.coli LLO/OVA刺激后4 h, BMDC出現Card4（NOD1）mRNA及其下游信號途徑相關的Rip2、 Ikk、 Ikk、 NFB1和NFB2 mRNA表達上調, 同時IFN、 Lta(TNF)和TNFsf5(CD40) mRNA也表達上調（圖1）。    RTPCR結果也證實BMDC在受E.coli LLO/OVA刺激后2 h出現TLR4 mRNA表達上調, 且表達水平略高于E.coli OVA刺激的

22、BMDC; BMDC經E.coli LLO/OVA刺激后48 h NOD1(Card4)mRNA持續表達上調, 而BMDC 僅在被E.coli OVA刺激6 h后出現Nod1(Card4)mRNA表達上調（圖2）。圖1  BMDC經E.coli LLO/OVA刺激后的基因表達（略）Fig 1  The mRNA expression of murine BMDC pulsed by E.coli LLO/OVA2.2  BMDC上調表達共刺激分子和MHCII類分子  在E.coliLLO/OVA刺激后24 h,  BMDC上調表達共刺激分子CD40、 CD