1、食品微生物檢驗技術課程實訓指導手冊項目九 方便面菌落總數快速檢驗-3M試紙片（依據 SN/T 0168-2015進出口食品中菌落總數計數方法與3M試紙片操作說明書）一、實訓目的以3M試紙片進行樣品中菌落總數計數，熟練使用各類3M試紙片進行檢驗操作，明確常用微生物快速檢驗方法的原理與優缺點與注意事項。二、實訓原理PetrifilmTM是3M公司專利發明，將傳統的瓊脂平板或試管的培養方法濃縮在小小的一張測試片上，現階段共有十余種測試片，比較常用的有：菌落總數測試片、大腸菌群計數測試片 、快速大腸菌群計數測試片、高靈敏度大腸菌群計數測試片、大腸桿菌/大腸菌群計數測試片 、腸桿菌科測試片、霉菌和酵母菌

2、計數測試片、快速金黃色葡萄球菌計數測試片、環境李斯特菌測試片三、實訓要求本項目3M試紙片進行樣品中菌落總數計數快速檢驗依據SN/T 0168-2015進出口食品中菌落總數計數方法與3M試紙片說明書進行檢驗操作，標準與操作說明書規定了3M試紙片進行樣品中菌落總數計數快速檢驗的基本要求、操作程序和結果判定。本項目全面考察學生依據標準與操作說明進行微生物快速檢驗的能力。本項目實施過程可分為樣品準備、接種、培養、計數4個步驟。本項目按2人/組為單位進行操作，要求在實驗室完整使用3M試紙片進行樣品中菌落總數計數快速檢驗。四、實驗材料和設備 1 試劑和溶液無菌生理鹽水、75%乙醇。2 儀器和設備除微生物實

3、驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料包括冰箱、天平、剪刀、鑷子、移液管、錐形瓶、試管、恒溫培養箱、均質器及耗材、達到精度要求的pH計，超凈工作臺或百級潔凈實驗室。五、實訓任務（包含結果計算）1、樣品制備以無菌操作取有代表性的樣品盛于滅菌容器內。如有包裝，用75%乙醇在包裝開口處擦拭后取樣。a） 固體和半固體樣品：無菌操作，稱取25 g樣品置盛225 mL生理鹽水的無菌均質杯內，8000 r/min10000 r/min均質1 min2 min，或放入盛有 225 mL 稀釋液的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打1 min2 min，制成 1:10 的樣品勻液。如樣品均質時間超過2 min，應

4、在均質杯外加冰水冷卻。b） 干粉：無菌操作，稱取25 g樣品，置盛225 mL生理鹽水和適量玻璃珠的無菌均質杯內，迅速振搖，將樣品混勻，制成 1:10 的樣品勻液。振搖時，幅度為30 cm，7 s內振搖25次，也可以極其振搖15 s。c） 液體樣品：以無菌吸管吸取25 mL樣品置盛有225 mL生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。吸取樣品時，吸管插入液面下不要超過2.5 cm。吸管內液體要在24 s內完全排入稀釋劑。不要在稀釋劑中吹洗吸管。無菌制備樣品，制備10-1、10-2、10-3適宜的稀釋度，并均質。在操作手冊中，首先介紹了3M試

5、紙片的合理存放，3M試紙片需要冷藏，并需注意保質期，且需在開包前將包裝物恢復至室溫；對于已開封的包裝，繼續存放時則需用膠帶封禁封口；并不在冷藏，同時注意需要在1個月內使用完。2、接種a） 選擇合適的連續3個稀釋度，揭開試紙片上層膜，接種1 mL樣液垂直滴加在試紙片中央處，做兩個平行重復，小心蓋上上層莫，注意不要有氣泡。b） 用包裝中適配的壓板凹面朝下，對準后，輕壓30秒后，靜置試紙片至少1 min待培養基凝固。3、培養3M試紙片透明面朝上，堆疊不超過20片，放入培養箱中培養，36±1，培養48±2 h。4、計數到培養時間后立即計數，如果不能立即進行計數，可以將試紙片放在-1

6、5條件下，不超過7 d.計算結果只保留兩位有效數字，見表1表1對所有成對的平板都要計數，并將計數的結果按規定的計算后報告。25250 CFU為正常計數范圍。不足25 CFU或者超過250 CFU計數結果可能不是實際菌落數的真實反映。因為菌落數過少的試紙片（少于25 CFU），稀釋因子可能會夸大計數結果；二菌落數過多的試紙片（超過250 CFU），一反面因為難以計數，另一方面因為會抑制某些細菌的生長，可能會導致計數結果低于實際菌數。報告時，將少于25 CFU或者多于250 CFU的試紙片計數結果報告為試紙片菌落計數的估計值（EAPC）。a） 菌落數在25250 CFU正常范圍內的試紙片：選擇無蔓

7、延菌落的平板，技術所有菌落，包括那些極微小的菌落，記錄下計數的每個試紙片的菌落數和稀釋倍數。計算公式：如表2表2結果修約后為2.4×104或者24000 CFU/mL(g)b） 超過250 CFU的試紙片：所有稀釋度試紙片上菌落數都超過250 CFU，對于接近250 CFU的試紙片，先劃出分布具有代表性的區域進行計數，再計算出整塊的菌落數，用EAPC來報告計算出的需氧菌落數，以表明該數值是從25250 CFU范圍外試紙片得出的估計值。其余試紙片都記錄為“多不可計”（TNTC）。如表3。c） 小于25 CFU的試紙片：所有測試片上菌落數都小于25 CFU，記錄測試片實際的菌落數，但報告

8、結果為小于25×（1/d），d為該計數的樣品的最低稀釋度的稀釋因子。如表4。表4d） 無菌落生長的試紙片。如果所有稀釋度的試紙片都沒有菌落生長，則APC報告為小于1乘以樣品的最低稀釋倍數，報告時將計算出的APC值標上星號，以表明該數值是從25250 CFU范圍外試紙片得出的估計值。六、原始數據記錄表菌落總數原始記錄樣品編號樣品名稱樣品狀態固態，無異常 液態，無異常 其他：樣品數量溫 度濕 度%檢驗方法檢測地點4 主要檢測儀器名稱及編號JM023 DHG-9140A型電熱鼓風干燥箱 JM049 GHP-9160型隔水式恒溫培養箱JM010 TD型電子天平 設備狀態正常 其他：檢驗項目測試數據記錄計算公式檢驗結果菌落總數CFU/ml(g)培養基、培養時間及溫度平板計數瓊脂、36±