1、賽萊西布對肝癌HepG2細胞增殖與凋亡影響(1)目的 探討選擇性環氧合酶-2(cox-2)抑制劑賽萊西布(celecoxib)對人肝癌細胞株HepG2細胞增殖、凋亡的影響及其可能的作用機制。方法 用不同濃度的賽來西布處理HepG2細胞，分別應用四甲基偶氮噻唑藍試驗、DNA梯度電泳法、放射免疫法檢測賽亞西布對HepG2細胞增殖和凋亡及其cox-2活性的影響；應用免疫印跡法和比色法檢測賽萊西布對HepG2細胞胱氨酸蛋白酶3(clasepase-3)蛋白質的表達及活性的影響。結果 125，25，50mol/L的賽萊西布作用于HepG2細胞后，HepG2細胞增殖受抑制，與對照組比較，差異有統計學意義(

2、P001)；賽萊西布干預組HepG2細胞DNA明顯降解，可見細胞凋亡特征性梯狀DNA條帶；干預組HepG2細胞caspase3蛋白表達及活性均明顯升高，與對照組比較，差異均有統計學意義(P001)；賽萊西布明顯抑制HepG2細胞cox-2活性，與對照組比較，差異有統計學意義(P001)。結論 賽萊西布可通過cox-2通路和caspase3通路抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡。關鍵詞： HepG2細胞;環氧合酶-2；賽萊西布；增殖;凋亡Effects of cyclooxygenase-2 on proliferation and apoptosis in HepG2 cells Abstra

3、ct： Objective To examine the effects of a selective inhibitor of cox-2,celecoxib on growth and apoptosis in HepG2 cells.Methods HepG2 cells were treated with various concentrations of celecoxib.Cell growth was measured by MTT,apoptosis was detected by DNA fragmentation assay,and cox-2 activity was m

4、easured by RIA;Expression of caspase-3 protein in HepG2 cells was determined by western blot,and caspase-3 activity was measured using colorimetric assay.Results After HepG2 cells were treated with different concentrations of celecoxib (12.5,25,50mol/L),celecoxib could significantly suppress the gro

5、wth of HepG2 cells respectively compared with the control group (P0.01),and celecoxib-treated HepG2 cells produced a distinct oligosomal ladder,the characteristics of cells undergoing apoptosis;Meanwhile,The caspas-3 expression and activity of celecoxib treated HepG2 cells were increased respectivel

6、y as compared with the control groups(P0.01).Furthermore,the level of cox-2 activity was reduced in celecoxib-treated HepG2 cells respectively compared with the control group (P0.01).Conclusion Celecoxib could inhibit the proliferation and increase apoptosis in HepG2 cells by cox-2 and caspase3 path

7、ways.Key words： HepG2 cell;cyclooxygenase-2;celeeoxib;proliferation;apoptosis近年來的研究表明，環氧合酶-2(cox-2)在結直腸癌、食管癌、肺癌等多種人類腫瘤組織中高表達1-3。最新報道顯示4，5，cox-2在肝癌組織中也高表達，并且在肝硬化組織中過表達，提示cox-2可能是腫瘤防治的一個新靶點3。非甾體類抗炎藥(nonsteroidal anti-inflammatory drugs，NSAIDs)具有預防和輔助治療腫瘤尤其胃腸道腫瘤的作用6，但NSAIDs抑制腫瘤的作用機制尚不明確。本研究選擇NSAIDs類藥物中

8、的1種高選擇性cox-2抑制劑賽萊西布(賽來西布)，作用于人肝癌細胞株HepG2觀察其對HepG2細胞增殖與凋亡的影響，并探討其可能的作用機制。結果報告如下。1 材料與方法11 材料 111 試劑 賽萊西布(celecoxib，美國Cayman公司)；四甲基偶氮噻唑藍(MTT，上海華美生物工程公司)；二硫代蘇糖醇(DTT，美國Promega公司)；兔抗aspase-3抗體、兔抗人cox-2多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；底物Ac-DEVD-pNa(N-Acetyl-Asp-Glu-Val-Asp-p-Nitroanilide)、核糖核酸酶-A(RNaseA)、4-(2-羥乙基)-1

9、-哌嗪乙烷磺酸(Hepes)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、蛋白酶抑制劑(aprotinin，美國Sigma公司)，RMPI-1640培養基、小牛血清美國Gibco公司)；PGE2放射免疫測定試劑盒(蘇州大學醫學院)。112 儀器 5415R低溫臺式高速離心機(德國Eppendorf公司)；HVE50凝膠成像系統(美國SYNGENE公司)；GS-930薄層掃描圖像分析儀(日本島津公司)；2123TC型CO2培養箱(美國Sheldon公司)；ELX800酶標儀(美國Bio-Tek公司)。12 方法 121 細胞培養 人肝腫瘤細胞株HepG2由廣西醫科大學實驗中心保存。HepG2細胞為貼壁細胞，用含1

10、0%小牛血清、100U/ml青霉素和100g/ml鏈霉素的RPMI-1640培養基在37、飽和濕度及5%CO2的細胞培養箱內傳代培養。122 MTT法測定賽萊西布對HepG2細胞增殖的影響 用25g/L胰蛋白酶消化對數生長期的HepG2細胞制備單細胞懸液。以每孔5103個細胞接種于96孔培養板，24h后換液，加入不同濃度賽萊西布使其終濃度分別為125，25，50mol/L。設不進行藥物干預的細胞為對照組。每種濃度平行4個復孔，繼續培養。MTT法7測定賽萊西布對HepG2細胞增殖的影響。123 DNA梯度電泳法檢測HepG2細胞凋亡DNA片斷 將1106個細胞接種于100ml培養瓶，細胞貼壁后換

11、液，加入賽萊西布使其終濃度分別為125，50mol/L。設不進行藥物干預的細胞為對照組。繼續培養48h，提取細胞基因組DNA，應用DNA梯度電泳法7檢測HepG2細胞凋亡DNA片斷。電泳結果用HVE50凝膠成像系統觀察、分析、拍照。124 放射免疫法檢測HepG2細胞cox-2活性 前列腺素E2(PGE2)是cox-2催化花生四烯酸產生前列腺素的主產物，可用細胞分泌PGE2的水平來反映cox-2的活性。因此，可采用賽萊西布對HepG2細胞分泌PGE2的能力的影響來反它對cox-2活性的影響：以1106/孔的密度將HepG2細胞接種于24孔板，24h后換培養基，設不進行藥物干預的細胞為對照組，1

12、25，25，50mol/L濃度的賽萊西布為干預組，每種濃度平行4復孔，繼續培養24h后收集上清。按PGE2放射免疫試劑盒說明測定PGE2。125 HepG2細胞caspase-3活性的測定 以1106個細胞接種于100ml培養瓶，細胞貼壁后換液，加入賽萊西布使其終濃度分別為125，25，50mol/L。設不進行藥物干預的細胞為對照組。繼續培養24h后，收集漂浮和貼壁的細胞，并加入預冷的細胞裂解液50mmol/L的Tris-Cl,200mmol/L的NaCl，2mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉鹽(EDTA)，1%(V/V)Triton X-100、01mmol/L的PMSF，冰上孵育10min后，

13、以15000r/min離心5min(4)，取上清，并對其蛋白定量8。以細胞裂解液將待測樣品蛋白濃度稀釋至4g/L。反應體系含40l待測樣品、10l的顯色底物Ac-DEVD-pNa(20mol/L)、50l 2反應緩沖液100mmol/L的Hepes、2%(V/V)甘油、5mmol/L的DTT、05mmol/L的EDTA，37水浴中避光孵育2h以上，以EL800酶標儀在450nm波長處測定樣品A值，以不加底物樣本作空白比色。caspase-3活性直接以A值表示。同時在賽萊西布作用細胞前2h預加入Ac-DEVD-CHO，2h后再加入賽萊西布使其終濃度分別為125，25，50mol/l，以下處理和檢

14、測同上。【關鍵詞】,HepG2細胞;環氧合酶-2；賽萊西布；增殖;凋亡摘 目的探討選擇性環氧合酶-2(cox-2)抑制劑賽萊西布( 本篇論文是由3COME文檔頻道的網友為您在網絡上收集整理餅投稿至本站的，論文版權屬原作者，請不用于商業用途或者抄襲，僅供參考學習之用，否者后果自負，如果此文侵犯您的合法權益，請聯系我們。126 Western blot檢測HepG2細胞caspase-3蛋白質表達 將1106個細胞接種于100ml培養瓶，細胞貼壁后換液，加入不同濃度賽萊西布使其終濃度分別為125，25，50mol/L。設不進行藥物干預的細胞為對照組。繼續培養48h后，用預冷的磷酸鹽緩沖度(PBS)

15、漂洗細胞，加入100l預冷的細胞裂解液50mmol/L的Tris-Cl,200mmol/L的NaCl，2mmol/L的EDTA，1%(V/V)的Triton X-100、01mmol/L的PMSF，于冰上孵育20min后，15000r/min4離心5min，提取蛋白，并測定蛋白含量8。以細胞裂解液將待測樣品蛋白濃度稀釋至4g/L。蛋白印跡(Western blot)法8檢測HepG2細胞caspase-3蛋白質表達。用DAB顯色試劑盒顯色，檢測雜交信號，島津CS-930薄層掃描圖像分析儀計算蛋白條帶的積分A值。13 統計分析 應用SPSS100軟件進行t檢驗。2 結果21 賽萊西布對HepG2

16、細胞增殖的影響 不同濃度賽萊西布作用于HepG2細胞72h后，125，25和50mol/L干預組的A值分別為139016，099012，058011，均顯著低于與對照組A值243026，差異有統計學意義(P0001)。表明賽萊西布對HepG2細胞增殖有明顯抑制作用，隨著藥物濃度增大，賽萊西布對HepG2細胞的增殖抑制作用更加明顯。22 賽萊西布對HepG2細胞凋亡的影響(圖1) 圖1可見，對照組HepG2細胞DNA電泳主表現為靠近加樣孔附近完整的基因組DNA，而賽萊西布干預組HepG2細胞DNA明顯降解，可見細胞凋亡的特征性梯狀DNA條帶。1：25mol/L；2：空白對照；3：50mol/L圖

17、1 不同濃度賽萊西布干預處理48h對HepG2細胞凋亡影響（略）23 賽萊西布對HepG2細胞caspase-3蛋白表達的影響 Western blot檢測結果顯示，不同濃度的賽萊西布干預處理HepG2細胞48h，干預組HepG2細胞的capase-3的蛋白表達均明顯升高，與對照組比較差異有統計學意義(P001，圖2，表1)。1：空白對照；2：12.5mol/L；3：25mol/L;4：50mol/L圖2 賽萊西布對HepG2細胞caspase-3蛋白表達水平影響（略）表1 賽萊西布對HepG2細胞caspase-3蛋白表達水平的影響（略）24 賽萊西布對HepG2細胞caspase-3活性的

18、影響 125，25和50mol/L干預組caspase-3活性分別為0240013，0440016，071009，均高于與對照組caspase-3活性0010012，差異有統計學意義(P0001)，表明賽萊西布可誘導HepG2細胞caspase-3活性的升高。進一步用caspase-3特異性抑制劑Ac-DEVD-CHO先于賽萊西布與細胞作用，2h后再加入賽萊西布作用24h，發現賽萊西布中Ac-DEVD-CHD處理組HepG2細胞caspase-3活性顯著低于賽萊西布組，表明Ac-DEVD-CHO能抑制賽萊西布誘導HepG2細胞的凋亡。25 賽萊西布對HepG2細胞cox-2活性的影響 125，

19、25和50mol/L干預組前列腺素E2(PGE2)水平(pg/(ml106 cells)分別為3610435，2627366和1765273，均顯著低于與對照組11228871，差異有統計學意義(P0001)，表明賽萊西布可明顯抑制HePG2細胞PGE2釋放水平。隨著藥物濃度的增加，PGE2釋放水平逐漸下降，表明賽萊西布可抑制HepG2細胞cox-2活性。3 討論本研究發現，用不同濃度賽萊西布作用于HepG2細胞后，對細胞生長增殖有明顯抑制作用，并且隨著濃度的增大，這種抑制作用更明顯，呈一定的劑量依賴關系。用DNA梯度凝膠電泳法觀察賽萊西布對HepG2細胞凋亡的影響，發現賽萊西布干預組的細胞基

20、因組DNA電泳表現為特征性的梯形條帶，說明cox-2參與了HepG2細胞凋亡過程。放射免疫法檢測顯示，HepG2細胞培養上清中有PGE2的釋放，賽萊西布可明顯抑制HepG2細胞PGE2釋放水平，減少PGE2產生。而PGE2是cox-2催化花生四烯酸產生PGs的主產物，說明賽萊西布可能通過抑制cox-2酶催化活性而減少PGE2產生，從而抑制HepG2細胞增殖，誘導其凋亡。本研究發現，賽萊西布以劑量依賴性方式誘導HepG2細胞caspase-3蛋白表達水平顯著增加，其活性也明顯升高，提示caspase-3活化介導了賽萊西布誘導的HepG2細胞凋亡。為進一步證實上述結論的可靠性，本研究用caspas

21、e-3特異性抑制劑Ac-DEVD-CHO預先作用于HepG2細胞，再施以賽萊西布干預。結果顯示，當封閉caspase-3的裂解激活，相同濃度賽萊西布誘導的HepG2細胞凋亡明顯受到抑制。提示賽萊西布可通過激活caspase-3而誘導腫瘤細胞凋亡。本研究結果顯示，賽萊西布可通過cox-2通路和caspase-3通路抑制HepG2細胞增殖并誘導其凋亡。最近，Ferrandina9等對14例患有頭頸部癌的病人給予短時期的賽萊西布處理后，病人平均cox-2表達水平顯著降低，Ki67明顯下降，腫瘤組織微血管密度值明顯降低。結合本研究結果，提示選擇性cox-2抑制劑是一種有應用前景的肝癌預防和治療的化學藥

22、物。參考文獻1 Zha S,Yegnasubramaniav V,Nelson WG,et al.Cyclooxygenases in cancer,progress and perspectiveJ.Cancer Lett,2004,215(1):1-20.2 Yu HP,Xu SQ,Liu L,et al.Cyclooxygenoase-2 expression in squamous dysplasia and squamous cell carcincma of the esophagusJ.Cancer Lett,2003,198(2):193-201.3 高雪芹，張維東.COX-2

23、在腫瘤組織的表達及其化學預防靶點的意義J.中國公共衛生，2002，18(2)：249.4 Sung YK,Hwang SY,Kim JO,et al.The correlation between cyclooxygenase-2 expression and hepatocellular carcinongenesisJ.Mol Cells,2004,29,17(1):35-38.5 Chi-Man Tang T,Tung-Ping Poon R,et al.The significance of cyclooxygenase-2 expression in human hepatocellular carcinomaJ.Biomed Pharmacother,2005,59(Supp