1、精選優質文檔-傾情為你奉上免疫金的特性膠體金可以和蛋白質等各種大分子物質結合，在免疫組織化學技術中，習慣上將膠體金結合蛋白質的復合物稱為金探針。用于免疫測定時膠體金多與免疫活性物質（抗原或抗體）結合，這類膠體金結合物常稱為免疫金復合物，或簡稱免疫金（immunogold）。膠體金與蛋白質結合的機制尚有十分清楚，一般認為是物理吸附性的。膠體金顆粒帶有一層表面陰性電荷，與蛋白質表面的陽性電荷通過靜電感應相附。因此環境pH和離子強度是影響吸附的主要因素，其他如膠體金顆粒的大小、蛋白質的分子量及蛋白質濃度等也會影響蛋白質的吸附。來源：Gold 2免疫金的制備1用0.2mol/LK2CO3或0.1mol

2、/LHC1調節膠體金溶液的pH至選定值。原則上可選擇待標記蛋白質等電點，也可略為偏堿。但通常最適反應pH往往需經多次試驗才能確定。 在調節膠體金的pH值時應注意，膠體金會阻塞pH計的電極，不可直接將電極插入膠體金溶液中，宜先用終濃度為0.15的聚乙二醇（PEG，20000）穩定膠體金后，再調膠體金的pH值。2將1/10體積的合適濃度的蛋白質溶液加于膠體金溶液中，放置室溫反應25min。由于鹽類成分能影響膠體金對蛋白質的吸附，并可使膠體金聚沉，因此待標記蛋白質溶液若含有較高的離子濃度，應在標記前先對低離子強度的蒸餾水透析去鹽。3加入濃度為0.2的PEG或BSA以飽和游離的膠體金。4離心分離，去除

3、上清液中未結合的蛋白質。離心條件視膠體金顆粒的粒徑而異：對5nm金顆粒可選用40000r/min離心1h；8nm金顆粒用25000r/min離心45min；14nm金顆粒用25000r/min離心30min，40nm金顆粒用15000r/min離心30min。5輕吸上清液。沉淀用含PEG或BSA的緩沖液懸浮，恢復原體積后再離心。如此洗滌24次。以徹底除去未結合的蛋白質。6免疫金復合物最終用稀釋液配制成工作濃度保存。稀釋液通常是加入穩定劑的緩沖液。緩沖溶液常用中性的PBS或Tris緩沖液。多種蛋白質、葡聚糖、PEG2000、明膠等均為良好的高分子穩定劑，PEG和BSA是最常用的穩定劑。穩定劑有兩

4、大作用：一為保護膠體金的穩定性，使之便于長期保存；二為防止或減少免疫金復合物的非特異性吸附反應。穩定劑的合理選擇是十分重要的，不適當的穩定劑有時也會導致非特異性反應。 免疫膠體金制備、蛋白質的處理：由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質溶液應絕對澄清無細小微粒，否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質的吸附。、蛋白質最適用量的選擇：將待標記的蛋白質儲存液作系列稀釋后，分別取 0.1ml(含蛋白質 540ug)加到 1ml 膠體金溶液中，另設一

5、管不加蛋白質的對照管，5分鐘后加入 0.1ml 10NaCl 溶液，混勻后靜置2小時，不穩定的金溶膠將發生聚沉，能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10即為最佳標記蛋白量。、標記：在接近并略為高于蛋白質等電點的條件下標記是比較合適的，在此情況下蛋白質分子在金顆粒表面的吸附量最大。下述標記步驟最為常見：用 0.1mol/L K2CO3 或 0.1mol/L HCl 調節金溶膠至所需 pH(標記SPA時調到 pH6.0)。于 100ml 金溶膠中加入最佳標記量的蛋白質溶液（體積為23ml），攪拌23分鐘。加入 5ml 1 PEG20000 溶液。于 10000g 離心 3060 分鐘（根據粒徑大小選擇不

6、同離心條件），小心吸去上清液（切忌傾倒）。將沉淀懸浮于一定體積含 0.20.5mg/ml PEG20000 的緩沖液中，離心沉淀后，再用同一緩沖液恢復，濃度以 1cm/540nm=1.5 左右為宜，以 0.5mg/ml 疊氮鈉防腐，置 4保存。包被后的金溶膠也可濃縮后于 Sephadex G-200 柱進行凝膠層析分離純化，以含 0.1BSA的緩沖溶液洗脫。通常用 IgG 包被的金溶膠洗脫液 pH 為 8.2，以A蛋白包被的金溶膠洗脫液為 pH7.0。以上操作中應注意，一切溶液中不應含雜質微粒，可用高速離心或微孔濾膜預處理。膠體金標記蛋白質的純化純化的目的就是除去其中未標記的蛋白質，未充分標記

7、的膠體金及在標記過程可能形成的各種聚合物。其純化方法有超速離心法、色譜柱法以及以上二者相結合應用。（一）超迷離心法根據膠體金顆粒大小不同及蛋白質種類不同，離心的轉速和時間也不同。用牛血清白蛋白穩定的膠體金標記羊抗兔IgG,可先從低速離心（20nm顆粒用250g;5nm用4800g20min），棄去聚集的金顆粒所形成的沉淀，然后將上清液5nm金標記物用60000g于4離心1h,20nm和40nm金標記物用14000g于4離心1h.小心地吸出上清，將管底沉淀再用1%牛血清白蛋白緩沖液混懸至原量，平衡過夜后，重復離心2次，最后一次洗滌離心的沉淀，再用1%牛血清白蛋白緩沖液（含0.02mol/LNaN

8、3）稀釋到l:20.40nm金顆粒在520nm檢驗吸光度為0.35;20nm金顆粒為0.30;5nm金顆粒為0.25,用1%牛血清白蛋白緩沖液作空白。制備的膠體金-蛋白探針可保存于4，如加入50%甘油可貯于0以下（-18）1年以上。以聚乙二醇穩定的葡萄球菌A蛋白標記膠體金，按膠體金制備方法及所得顆粒大小不同，用不同離心轉速分離純化，以白磷還原法制備的5.0nm膠體金A蛋白，用×g離心；抗壞血酸法制備的11.3nm膠體金-A蛋白，用g離心45min,可見離心管底部附貼有小片緊密的沉淀，其上為較疏松的紅色沉積物，再上為透明的上清液。附貼管底的沉淀無用，以后操作步驟中不要攪起來，仍保持其貼

9、于管底。棄去上清液后，用等體積的0.0lmol/LPBS（pH7.2）溶解疏松紅色沉積物，同上重復離心1次，小心移去上清液，剩余0.5ml上清液，將疏松紅色沉積物溶解后，即為初步提純的金標-A蛋白試劑。（二）凝膠過濾法凝膠過濾法必須以BSA為穩定劑。將前述膠體金-蛋白質復合物裝入透析袋內，置硅膠中濃縮至原體積1/10左右，用蒸餾水沖洗軟化透析袋后，取出濃縮液，以15000r/min離心15min（或用上述離心法純化后的膠體金，再進一步用此方法純化）。吸取上清液加到丙烯葡聚糖S-400（SephacrylS-400,Pharmacia公司產品，Sweden）色譜柱上分離純化。柱床高20cm,直徑

10、0.8cm,加樣體積為柱床體積的1/10.用0.02mol/LTBS液（內含0.1%BSA,0.05mol/LNaN3,pH8.2者用于膠體金標記IgG,pH7.0者用于膠體金標記蛋白A）洗脫，流速為8ml/h,按紅色深淺分管收集洗脫液。可見先濾出的液體呈微黃色，有時略濁，內含大顆粒聚合物等雜質。純化的金標記蛋白濾出液隨濃度增加而紅色逐漸加深，清亮透明，此后為略呈黃色的未標記蛋白組分。表中列出膠體金與蛋白質結合后，用離心法純化的條件。表6-8列出幾種免疫金探針離心純化的條件，僅供參考。超迷離心轉速與金顆粒直徑的關系顆粒直徑/nm離心力/g 顆粒直徑/nm離心力/g 2-3 1041564000

11、4-451520140006-48 幾種免疫金探針離心純化條件膠體金顆粒/nm pH 標記蛋白質離心力/g時間/min59.0羊抗人IgG 4500045 108.2McAb4500030156.5鏈霉親和素 45 206.0SPA 30109.0羊抗兔IgG 60來源：趙 需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1N HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可.蛋白 與膠體金結合的最佳pH測定：取若干1.5ml的試管，分別加入1ml膠體金用K2CO3將pH分別調為3，4，5，6，7，8，9，10；去9

12、6孔培養板，按pH從高到低分別將上述膠體金分別取100ul加入孔中，重復三次；每孔分別加入20ul濃度為10%的NaCl溶液，混合，室溫下放置10min；觀察膠體金顏色變化，記錄保持紅色的最低pH。最小蛋白用量的確定：光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測定，以OD值為縱坐標，蛋白質用量為橫坐標作一曲線，取曲線最先與橫軸相接近的那一點處的蛋白質用量為最適穩定量。圖5.2中10nm的膠體金溶液中蛋白質的最適穩定量為45g/

13、ml。 來源： 膠體金標記的實驗操作（1）蛋白質的處理：膠體金標記蛋白的制備  膠體金對蛋白的吸附主要取決于pH值，在接近蛋白質的等電點或偏堿的條件下，二者容易形成牢固的結合物。如果膠體金的pH值低于蛋白質的等電點時，則會聚集而失去結合能力。除此以外膠體金顆粒的大小、離子強度、蛋白質的分子量等都影響膠體金與蛋白質的結合。1）待標記蛋白溶液的制備  將待標記蛋白預先對0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4透析過夜，以除去多余的鹽離子，然后100 000g4離心1h，去除聚合物。2）待標膠體金溶液的準備  以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L

14、HCl調膠體金液的pH值。標記IgG時，調至9.0；標記McAb時,調至8.2；標記親和層析抗體時，調至7.6；標記SPA時，調至5.96.2；標記ConA時，調至8.0；標記親和素時，調至910。由于膠體金溶液可能損壞pH計的電板，因此，在調節pH時，采用精密pH試紙測定為宜。由于鹽類成分能影響金溶膠對蛋白質的吸附，并可使溶膠聚沉，故致敏前應先對低離子強度的水透析。必須注意，蛋白質溶液應絕對澄清無細小微粒，否則應先用微孔濾膜或超速離心除去。 一般情況下應避免磷酸根離子和硼酸根離子的存在，因為它們都可吸附于顆粒表面而減弱膠體金對蛋白質的吸附。（2）蛋白質最適用量的選擇：膠體金與標記蛋白用量之比

15、的確定1）根據待標記蛋白的要求，將膠體金調好pH之后，分裝10管，每管1ml。2）將標記蛋白（以IgG為例）以0.005Mol/L pH9.0硼酸鹽緩沖液做系列稀釋為5µg/ml50µg/ml，分別取1ml，加入上列金膠溶液中，混勻。對照管只加1ml稀釋液。3）5min后，在上述各管中加入0.1ml 10NaCl溶液，混勻后靜置2h，觀察結果。4）結果觀察，對照管（未加蛋白質）和加入蛋白質的量不足以穩定膠體金的各管，均呈現出由紅變藍的聚沉現象；而加入蛋白量達到或超過最低穩定量的各管仍保持紅色不變。以穩定1ml膠體金溶液紅色不變的最低蛋白質用量，即為該標記蛋白質的最低用量，在

16、實際工作中，可適當增加1020。將待標記的蛋白質儲存液作系列稀釋后，分別取0.1ml(含蛋白質540ug)加到 1ml膠體金溶液中，另設一管不加蛋白質的對照管，5分鐘后加入0.1ml 10%NaCl溶液，混勻后靜置2小時，不穩定的金溶膠將發生聚沉，能使膠體金穩定的最適蛋白量再加10%即為最佳標記蛋白量。（3）標記：膠體金與蛋白質（IgG）的結合  將膠體金和IgG溶液分別以0.1Mol/L K2CO3調pH至9.0，電磁攪拌IgG溶液，加入膠體金溶液，繼續攪拌10min，加入一定量的穩定劑以防止抗體蛋白與膠體金聚合發生沉淀。常用穩定劑是5胎牛血清（BSA）和1聚乙二醇（分子量20KD

17、）。加入的量：5BSA使溶液終濃度為1%；1%聚乙二醇加至總溶液的1/10。（4）膠體金標記蛋白的純化1）超速離心法：根據膠體金顆粒的大小，標記蛋白的種類及穩定劑的不同選用不同的離心速度和離心時間。用BSA做穩定劑的膠體金羊抗兔IgG結合物可先低速離心（20nm金膠粒用1 200r/min，5nm金膠粒用1 800r/min）20min，棄去凝聚的沉淀。然后將5nm膠體金結合物用6 000g，4離心1h；20nm40nm膠體金結合物，14 000g，4離心1h。仔細吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PB液（含0.02%NaN3），將沉淀重懸為原體積的1/10，4保存。如在結合物內加50%甘油可貯

18、存于-18保存一年以上。為了得到顆粒均一的免疫金試劑，可將上述初步純化的結合物再進一步用10%30%蔗糖或甘油進行密度梯度離心,分帶收集不同梯度的膠體金與蛋白的結合物。2）凝膠過濾法：此法只適用于以BSA作穩定劑的膠體金蛋白結合物的純化。將膠體金蛋白結合物裝入透析袋，在硅膠中脫水濃縮至原體積的1/51/10。再經1 500r/min離心20min。取上清加至Sephacryl S-400（丙烯葡聚糖凝膠S-400）層析柱分別純化。層析柱為0.8 cm×20cm，加樣量為床體積的1/10，以0.02Mol/L PBS液洗脫（內含0.1%BSA，0.05%NaN3，pH8.2者用IgG標

19、記物），流速為8ml/h。按紅色深淺分管收集洗脫液。一般先濾出的液體為微黃色，有時略混濁，內含大顆粒聚合物等雜質。繼之為純化的膠體金蛋白結合物，隨濃度的增加而紅色逐漸加深，清亮透明，最后洗脫出略帶黃色的為標記的蛋白組分。將純化的膠體金蛋白結合物過濾除菌、分裝,4保存。最終可得到70%80%的產量。膠體金蛋白結合物的質量鑒定（1）膠體金顆粒平均直徑的測量：用支持膜的鎳網（銅網也可）蘸取金標蛋白試劑，自然干燥后直接在透射電鏡下觀察。或用醋酸鈾復染后觀察。計算100個金顆粒的平均直徑。（2）膠體金溶液的OD520nm值測定：膠體金顆粒在波長510nm550nm之間出現最大吸收值峰。用0.02Mol/L pH8.2 PBS液（含1%BSA，0.02%NaN3）將膠體金蛋白試劑作1:20稀釋，OD5200.25左右。一般應用液的OD520應為0.20.4。（3）金標記蛋白的特異性與敏感性測定：采用微孔濾膜免疫金銀染色法（MFIGSSA）。將可溶性抗原（或抗體）吸附于載體上（濾紙、硝酸纖維膜、微孔濾膜），用膠體金標記的抗體（或抗原）以直接或間接染色法并經銀顯影來檢測相應的抗原或抗體，對金標記蛋白的特異性和敏感性進行鑒定。來源：膠體金