1、細胞計數方法細胞計數板法實驗原理：當待測細胞懸液中細胞均勻分布時，通過測定一定體積懸液中的細胞的數 目，即可換算出每毫升細胞懸液中細胞的細胞數目。具體操作：1. 將計數板及蓋片擦拭干凈，并將蓋片蓋在計數板。2. 將細胞懸液吸出少許，滴加在蓋片邊緣，使懸液充滿蓋片和計數板之間，靜置 注意蓋片下不要有氣泡，也不能讓懸液流入旁邊槽中。3. 計算板四大格細胞總數，壓線細胞只計左側和上方的。然后按公式計算：細胞數/mL=四大格細胞總數/4X 104個/ml3min,（注：當細胞很多時，可在四個格中選一定數目較平均的小格，由于每大格中有格，然后計左側和上方的細胞數，求出每小格的細胞數，取平均值m，mX16

2、即每個格的平均值。所以，細胞密度=mX 16X104個/ml）16個小說明：公式中除以4,因為計數了 4個大格的細胞數。公式中乘以104因為計數板中每一個大格的體積為:1.0mm （長）X 1.0mm （寬）X 0.1mm （高）=0.1mm3 而 1ml=1000ul=1000mm3（注意：鏡下偶見有兩個以上細胞組成的細胞團，應按單個細胞計算, 上，說明分散不好，需重新制備細胞懸液。）若細胞團10%以細胞計數板的使用一、血球計數板-基本構造血球計數板是一塊特制的厚型載玻片，載玻片上有四個槽構成三個平臺。 寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各刻有一小方格網， 九個大格，中央的一大格

3、作為計數用，稱為計數區。計數區的刻度有兩種：一種是計數區 分為16個大方格（大方格用三線隔開），而每個大方格又分成25個小方格；另一種是一個計數區分成25個大方格（大方格之間用雙線分開），而每個大方格又分成16個小方格。 但是不管計數區是哪一種構造，它們都有一個共同特點，即計數區都由400個小方格組成。中間的平臺較 每個方格網共分計數區邊長為1mm，則計數區的面積為1mm2，每個小方格的面積為1/400mm 2。蓋上蓋 玻片后，計數區的高度為0.1mm，所以每個計數區的體積為0.1mm3，每個小方格的體積 為 1/4000mm 3。使用細胞計數板計數時，先要測定每個小方格中微生物的數量，再換算

4、成每毫升菌液（或 每克樣品）中微生物細胞的數量。二、細胞計數板-使用方法1.視待測菌懸液濃度，加無菌水適當稀釋（斜面一般稀釋100倍），以每小格的菌數可數為度。2 .取潔凈的細胞計數板一塊，在計數區上蓋上一塊蓋玻片。3 .將菌懸液搖勻，用滴管吸取少許，從計數板中間平臺兩側的溝槽內沿蓋玻片的下邊緣 摘入一小滴（不宜過多），讓菌懸液利用液體的表面張力充滿計數區，勿使氣泡產生，并 用吸水紙吸去溝槽中流出的多余菌懸液。也可以將菌懸液直接滴加在計數區上（不要使計 數區兩邊平臺沾上菌懸液，以免加蓋蓋玻片后，造成計數區深度的升高），然后加蓋蓋玻 片（勿使產生氣泡）。4 .靜置片刻，使細胞沉降到計數板上，不再

5、隨液體漂移。將細胞計數板放置于顯微鏡的 載物臺上夾穩，先在低倍鏡下找到計數區后，再轉換高倍鏡觀察并計數。由于生活細胞的 折光率和水的折光率相近， 觀察時應減弱光照的強度。5計數時若計數區是由16個大方格組成，按對角線方位，數左上、左下、右上、右下的 4個大方格（即100小格）的菌數。如果是 25個大方格組成的計數區，除數上述四個大方 格外，還需數中央1個大方格的菌數（即80個小格）。為了保證計數的準確性，避免重復 計數和漏記，在計數時，對沉降在格線上的細胞的統計應有統一的規定。如菌體位于大方 格的雙線上，計數時則數上線不數下線，數左線不數右線，以減少誤差。即位于本格上線和左線上的細胞計入本格，

6、本格的下線和右線上的細胞按規定計入相應的格中。見下圖： 即本格中計數細胞為3個。6.對于出芽的酵母菌，芽體達到母細胞大小一半時，即可作為兩個菌體計算。每個樣品 重復計數2-3次（每次數值不應相差過大，否則應重新操作），按公式計算出每mL （g）菌懸液所含細胞數量。放入盒內保存。7 .測數完畢，取下蓋玻片，用水將細胞計數板沖洗干凈，切勿用硬物洗刷或抹擦，以免 損壞網格刻度。洗凈后自行晾干或用吹風機吹干，三、細胞計數板-計數公式/ml=100小格內細胞個數1、16格X25格的細胞計數板計算公式：細胞數/100 X400 X10000 X稀釋倍數1、25格X6格的細胞計數板計算公式：細胞數 稀釋倍數

7、/ml=80小格內細胞個數/80 >400 X10000 X四、血細胞計數板計數的誤差主要來自哪些方面 ？應如何盡量減少誤差，力求準確？血細胞計數的誤差分別來源于技術誤差和固有誤差。其中由于操作人員采血不順利，器材 處理、使用不當，稀釋不準確，細胞識別錯誤等因素所造成的誤差屬技術誤差；而由于儀 器(計數板、蓋片、吸管等)不夠準確與精密帶來的誤差稱儀器誤差，由于細胞分布不均 勻等因素帶來的細胞計數誤差屬于分布誤差或計數域誤差(filed error)。儀器誤差和分布 誤差統稱為固有誤差或系統誤差。技術誤差和儀器誤差可通過規范操作、提高熟練程度和 校正儀器而避免或糾正，但細胞分布誤差卻難于徹

8、底消除。因此，搞好紅細胞計數的質量 控制一般需采用以下措施。1. 避免技術誤差，糾正儀器誤差(1) 所用器材均應清潔干燥，計數板、血蓋片、微量吸管及刻度吸管的規格應符合要求或經過校正。計數板的鑒定：要求計數室的臺面光滑、透明，劃線清晰，計數室劃線面積 準確。必要時采用嚴格校正的目鏡測微計測量計數室的邊長與底面積，用微米千分尺測量 計數室的深度。美國國家標準局(NBS )規定每個大方格邊長的誤差應小于1%，即1±).01mm，深度誤差應小于 2%，即0.1 ±.002mm。若超過上述標準，應棄之不用。血 蓋片應具有一定的重量，平整、光滑、無裂痕，厚薄均勻一致，可使用卡尺多點測

9、量(至少在9個點)，不均勻度在0.002mm之內。必要時采用平面平行儀進行測量與評價，要求 呈現密集平行的直線干涉條紋。最簡單的評價方法是將潔凈的蓋片緊貼于干燥的平面玻璃 上，若能吸附一定的時間不脫落，落下時呈弧線形旋轉，表示蓋片平整、厚薄均勻。同 時，合格的蓋片放置在計數室表面后，與支持柱緊密接觸的部位可見到彩虹。精選出的蓋 片與其他蓋片緊密重合后，在掠射光線下觀察，如見到完整平行的彩虹條紋表示另一枚蓋 片質量也符合要求。目前臨床實驗室多采用一次性微量采血管采集毛細血管血，除注意 定點購買使用信譽較好廠家的產品外，還應對每一批量的采血管進行抽樣檢查，可通過水 銀稱重法或有色溶液比色法進行校正

10、，誤差不應超過±%。(2) 紅細胞稀釋液應等滲、新鮮、無雜質微粒。(3) 嚴格操作，從消毒、采血、稀釋、充池到計數都應規范，尤其應注意的是血樣稀釋及 充池時既要作到充分混勻，又要防止劇烈震蕩為破壞紅細胞。必須一次性充滿計數室，防 止產生氣泡，充入細胞懸液的量以不超過計數室臺面與血蓋片之間的矩形邊緣為宜。(4) 報告法定計量單位。2. 縮小計數域誤差或分布誤差由于血細胞在充入計數室后呈隨機分布或稱Po isson分布(P(x=k)= (k=0,12)，而我們所能計數的細胞分布范圍是有限的，由此造成k!的計數誤差稱為計數域誤差或分布誤差。縮小這種誤差的有效方法就是盡量擴大細胞計數 范圍和

11、計數數目，一般先進行誤差估計，然后決定所需計數的數目和計數范圍，只要能將 誤差控制在允許范圍內即可。Berkson指出，當使用同一支吸管、同一面計數室，計數0.2mm2面積的細胞數，有望將 CV控制在可接受的7%以內。對于紅細胞計數而言，由于 紅細胞數量較多，在計數室中顯得比較 擁擠”，根據Poisson公式推斷，。欲將誤差控制 在變異百分數5%以內，至少需要在計數室中計數 400個紅細胞，因此要求計數五個中方格 的紅細胞。事實上Berkson還通過實驗證明，紅細胞的計數域誤差為 s=0.92，較理論誤差 (Poisson分布誤差)要小。3排除異常標本的干擾白細胞數量在正常范圍時，相對于紅細胞

12、數量來講，其影響可忽略，但如白細胞過高(>100X109/L)，則應對計數結果進行校正。方法是：實際RBC=計得RBC-WBC。如當紅細胞換算后為 3.5 X012/L、白細胞換算后為100X109/L時, 病人實際紅細胞數應為 3.4 X012/L0在高倍鏡下計數時，避開有核細胞。有核細胞體積 比正常紅細胞大,中央無凹陷,無草黃色折光,可隱約見到細胞核。此外,當病人急性嚴 重貧血時網織紅細胞可提前大量釋放，也給紅細胞計數帶來一定的干擾，而且影響網織紅 細胞絕對值計算結果0其校正方法有待探討0Using a Counting ChamberFor microbiology, cell c

13、ulture, and many applications that require use of suspensions of cells it is necessary to determine cell concentration. One can often determine cell density of a suspension spectrophotometrically, however that form of determination does not allow an assessment of cell viability, nor can one distingu

14、ish cell types.A device used for determining the number of cells per unit volume of a suspension is called a counting chamber. The most widely used type of chamber is called a hemocytometer, since it was originally designed for performing blood cell counts.To prepare the counting chamber the mirror-

15、like polished surface is carefully cleaned with lens paper. The coverslip is also cleaned. Coverslips for counting chambers are specially made and are thicker than those for conventional microscopy, since they must be heavy enough to overcome the surface tension of a drop of liquid. The coverslip is

16、 placed over the counting surface prior to putting on the cell suspension. The suspension is introduced into one of the V-shaped wells with a pasteur or other type of pipet. The area under the coverslip fills by capillary action. Enough liquid should be introduced so that the mirrored surface is jus

17、t covered. The charged counting chamber is then placed on the microscope stage and the counting grid is brought into focus at low power.It is essential to be extremely careful with higher power objectives, since the counting chamber is much thicker than a conventional slide. The chamber or an object

18、ive lens may be damaged if the user is not not careful. One entire grid on standard hemacytometers with Neubauer rulings can be seen at 40x (4x objective). The main divisions separate the grid into 9 large squares (like a tic-tac-toe grid). Each square has a surface area of one square mm, and the de

19、pth of the chamber is 0.1 mm. Thus the entire counting grid lies under a volume of 0.9 mm-cubedSuspensions should be dilute enough so that the cells or other particles do not overlap each other on the grid, and should be uniformly distributed. To perform the count, determine the magnification needed

20、 to recognize the desired cell type. Now systematically count the cells in selected squares so that the total count is 100 cells or so (number of cells needed for a statistically significant count). For large cells this may mean counting the four large corner squares and the middle one. For a dense

21、suspension of small cells you may wish to count the cells in the four 1/25 sq. mm corners plus the middle square in the central square. Always decide on a specific counting patter to avoid bias. For cells that overlap a ruling, count a cell as "in" if it overlaps the top or right ruling, a

22、nd "out" if it overlaps the bottom or l?eft ruling.Here is a way to determine a particle count using a Neubauer hemocytometer. Suppose that you conduct a count as described above, and count 187 particles in the five small squares described. Each square has an area of 1/25 mm-squared (that

23、is, 0.04 mm-squared) and depth of 0.1 mm. The total volume in each square is (0.04)x(0.1) = 0.004 mm-cubed. You have five squares with combined volume of 5x(0.004) = 0.02 mm-cubed. Thus you counted 187 particles in a volume of 0.02 mm-cubed, giving you 187/(0.02) = 9350 particles per mm-cubed. There are 1000 cubic millimeters in one cubic centimeter (same as a milliliter), so your particle count is 9,350,000 per ml.Cells are often large enough to require counting over a larger surface area. For example, you might count the total number of cells in the four large