1、對照檢測病原體單細胞懸液的制作與保存    作者：任興昌,盧晴晴,陳洪勛【關鍵詞】  病原體;單細胞懸液；染色The Preparation and Preservation of Single Cell Suspension of PathogenicKey words：Pathogenic；Single cell suspension;Stain病原體單細胞懸液有廣泛的應用前景，尤其在臨床實驗、病理診斷中更是具有十分重要的作用。由于無論是機器操作還是手工操作均不能保證每張玻片的條件(如時間、劑量、效價程度或其他因素等)相同，到目前為止還沒有

2、設立真正意義上的對照的方法，除少數試劑可于片中尋找自身對照外，部分結果陽性、陰性及陽性的度以及結果的準確性較難判定。而單細胞懸液的制作選擇各種已知陽性組織、細胞以及病原體標本，制成可以長期保存的含有均勻分散的單細胞懸浮液體對照物質，在進行玻片實驗時將相應的對照物質點、涂少許于玻片上，同實驗對象一起進行實驗，以建立真正的對照，判斷的結果準確可靠。為此，我們對與病原體形態檢測有關的對照物質的制作與保存做了一些研究探討。1  材料與方法選擇我院臨床活檢取自外陰及宮頸贅生物，10甲醛固定的尖銳濕疣病例、白色假絲酵母菌培養物(光滑型1個培養皿、粗糙型2個培養皿)、外周血淋巴細胞培養物、腎小管上

3、皮細胞培養物以及取自腎病變組織的腎結核各1例。均進行細胞分散，常規HE染色(即蘇木精伊紅染色)/ZiehlNeelsen抗酸桿菌染色，經顯微鏡鏡檢后證明單細胞懸液在臨床實驗與病理鏡檢中的可行性。11  試劑  由于實驗對象的不同，實驗所需試劑有所區別。通用試劑1：PBS緩沖溶液;通用試劑2：生理鹽水(每整瓶生理鹽水+肝素1支)；通用試劑3：10甲醛溶液;通用試劑4：HE染色劑;通用試劑5：保存液；外周血淋巴細胞培養物所需試劑：紅細胞裂解液;外周血淋巴細胞培養物腎小管上皮細胞培養物所需試劑：70乙醇溶液;腎結核所需試劑：ZiehlNeelsen抗酸桿菌染色劑;尖銳濕疣所需試劑

4、：膠原酶。12  實驗步驟121  白色假絲酵母菌培養物(光滑型粗糙型)單細胞懸液的制備  將光滑型與粗糙型白色假絲酵母菌分涂布于冷卻的培養基上，室溫培養24 h。分別挑取適量的光滑型與粗糙型白色假絲酵母菌加入含肝素的生理鹽水中置于震蕩器上混勻后，各加入2滴10甲醛溶液固定30 min。3 000 rmin離心10 min后，棄上清。用生理鹽水(含肝素)清洗，3 000 rmin離心10 min，棄上清，重復此步驟2次3次加1倍5倍保存液，震蕩混勻，4 冰箱保存。取混合液1滴于玻片，常規HE染色。烘干，中性樹肢封片，顯微鏡鏡檢。12.2  腎小管上皮細胞

5、培養物單細胞懸液的制作  將培養物連同液體培養基一起加入50 ml離心管，2 000  rmin離心10 min，去上清。加入PBS緩沖溶液清洗培養基，2 000  rmin離心10 min，去上清液，重復此步驟2次。加入適量PBS緩沖溶液，并加入110量的70乙醇溶液進行固定。2 000  rmin離心10 min，去上清。加入適量PBS緩沖溶液，2 000  rmin離心10 min，去上清。重復此步驟2次。加1倍5倍組織量的保存液，震蕩混勻后，4 冰箱保存。取少許于玻片上，常規HE染色。烘干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢。123 

6、腎結核(病變組織已固定)單細胞懸液的制作  取50 ml離心管2支，加入已固定的和機械絞碎的富含結核桿菌的組織。將已固定的腎結核以3 300 r/min離心15 min，去上清。加入PBS緩沖溶液清洗，3 300  rmin離心15 min，去上清。重復此步驟2次3次。加1倍5倍保存液，震蕩混勻，4 冰箱保存。取少許于玻片上，ZiehlNeelsen抗酸桿菌染色。烘干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢。124  10甲醛固定的尖銳濕疣組織單細胞懸液的制作  取已固定的尖銳濕疣組織，用PBS緩沖溶液漂洗，然后將其切碎成為1 mm25 mm2左右的小塊，280目篩網

7、過濾。將過濾后的混合液2 000  rmin，離心10 min，去上清。加入30倍50倍組織量的膠原酶，密封。離心管放入37 恒溫箱，每隔30 min振搖一次，消化24 h，2 000  rmin離心10 min，去上清。加入PBS緩沖溶液清洗，2 000 r/min離心10 min，去上清。重復此步驟2次。加入25倍組織量紅細胞裂解液，震蕩混勻10 min15 min，進行充分裂解。2 000 rmin離心10 min，去上清。加入PBS緩沖溶液清洗，2 000 rmin離心10 min，去上清。重復此步驟2次。加入1倍5倍組織量保存液，震蕩混勻，置于4 冰箱保存。取少許

8、于玻片上，常規HE染色。烘干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢。12.5  外周血淋巴細胞培養物單細胞懸液制作  取適量外周血淋巴細胞培養物于50 ml離心管中，加入25倍組織量的紅細胞裂解液進行紅細胞裂解。震蕩器混勻10 min15 min，充分裂解。3 000 rmin離心10 min后，去上清。加入25倍紅細胞裂解液，震蕩混勻10 min15 min，重復此步驟2次。3 000 rmin離心10 min，去上清。加適量生理鹽水(含肝素)，加入15倍組織量的70乙醇溶液固定30 min。3 000 r/min離心10 min，去上清。加適量生理鹽水(含肝素)，加2滴3滴10甲醛

9、固定10 min。3 000 rmin離心10 min，去上清。生理鹽水(含肝素)3 000 rmin離心10 min，去上清。重復此步驟2次。加入1倍5倍保存液，震蕩混勻，4 冰箱保存。取少許于玻片上，常規HE染色。烘干，中性樹膠封片，顯微鏡鏡檢。2  實驗結果將不同的實驗材料做成單細胞懸液，按照一定的濃度比例(一般是1115)保存在保存液中。鏡檢后的結果基本有效的反映了材料的真實情況。21  白色假絲酵母菌單細胞懸液  制作后的白色假絲酵母單細胞懸液，經過常規HE染色后鏡檢，可以看到大量的菌體以一定的均勻度分布于鏡下，細胞分散良好，染色均勻，大大提高了觀察效率

10、。22  腎小管上皮細胞培養物單細胞懸液  腎小管上皮細胞培養物是很好的實驗材料，將其制成單細胞懸液后，經常規HE染色后鏡檢，可以看見腎小管上皮細胞均勻分布于玻片上，形態清楚，鏡檢效果良好。23  腎結核單細胞懸液  腎結核是從腎結核患者的腎病變組織中直接取出，它含有大量的干酪類物質，在一定程度上會影響對腎結核桿菌的鏡檢效果。將其制成單細胞懸液，經ZiehlNeelsen抗酸桿菌染色后，可見大量的桿菌分布于玻片上，雜質大大減少，能很好的進行鏡檢。24  10甲醛固定的尖銳濕疣組織單細胞懸液  尖銳濕疣組織經切碎過濾后加入膠原酶，有效消

11、化細胞間質，從而達到分散細胞的目的。常規HE染色后鏡檢，可觀察到細胞呈單個或小型細胞團塊分布于玻片上，能較好的進行鏡檢。25  外周血淋巴細胞培養物單細胞懸液  制作后的外周血淋巴細胞培養物單細胞懸液，經過常規HE染色后鏡檢，可以看見部分淋巴細胞以及部分紅細胞存在，細胞分散情況一般。紅細胞的存在干擾了對淋巴細胞的鏡檢效果，鏡檢效果一般。3  討論本實驗是由一組實驗所構成的，它的實驗對象包括培養物和非培養物，通過對其單細胞懸液的制作證明實驗的實際可操作性，為臨床診斷及醫療方案的判斷和選擇奠定了一定的基礎。實驗中采用了多種實驗對象，是為能探索各種病原體陽性、陰性對照物

12、質的單細胞制作方法，也是為了能在實驗進行的同時有利于發現各個方面的問題所在。培養物的單細胞懸液制作簡單方便，需要注意的是離心速度。離心速度過小或時間過短，組織細胞容易懸浮，造成不必要的損失；而離心速度過大或時間過長，會擠壓細胞造成細胞凝集重新變成團塊狀，不利于均勻分散懸浮1。相對的，非培養物病原體單細胞懸液的制作就比較麻煩2。尤其是作為實體組織的尖銳濕疣組織，它需要注意的事項比較多。首先是組織的切碎，人工或機器的機械法分離都會在一定程度上損傷組織細胞，造成大量細胞碎片3。其次，由于經過過濾，此時的液體中既含有單個的細胞和細胞團塊，也包含了一些數量龐大的細胞碎片。因此在離心時要注意離心的速度，太

13、慢會造成細胞的懸浮，既不能有效去除碎片，更損失有用的細胞；同樣，太快會擠壓細胞造成過度凝集，而且還會使得在最后的檢測中發現大量殘余的細胞碎片，影響結果；膠原酶的消化效果并不是很稱心，不能做到將細胞完全分離的程度；在膠原酶作用期間要注意無菌工作，以免在37 恒溫箱中消化的過程中滋生一些不必要的細菌，影響到最后的檢測；細胞在保存液中的狀態，不同的細胞其保存液的濃度不同，這就要求調試到最適合濃度以使得細胞在液體中能保持單個的均勻分散的狀態4。從這一系列實驗的結果來看，病原體單細胞懸液還是具有較強的實際可操作性。但其制作過程還需要不斷的進步，特別是針對組織的分離方面。【參考文獻】1 司徒鎮強，吳軍正細胞培養M世界圖書出版公司，1996：62692 張