1、固態相的合成多肽藥物的研究與開發作為二十一世紀高新技術竟爭的主要項目之一。生物活性多肽在內源性物質中占有非常重要的地位，除酶、受體、金屬蛋白等生物大分子外，許多合成或分離的多肽對生理過程或病理過程，對疾病的發生、發展或治療過程有重要意義。氨基酸彼此以酰胺鍵（也稱肽鍵）相互連接的化合物稱作肽。一種肽含有的氨基酸少于10個就稱作寡肽，超過的就稱為多肽。多肽與蛋白質只有肽鏈長短之別，二者間并沒有嚴格的區分。蛋白質是生命存在的最基本形式。可見多肽是生命之"橋"，蛋白質工程從某種意義上而言就是研究多肽。事實上，肽類藥物開發與應用已走出科學家們的實驗室，變成了現實，并發揮著其獨特的功效

2、。例如，神經緊張肽（NT）能降低血壓，對腸和子宮具有收縮作用；內啡肽和腦啡肽的衍生物有著很強的鎮痛作用；促甲狀腺素釋放激素（TRH）是一種能促進產婦乳汁分泌的多肽；能治療糖尿病、胃潰瘍、胰腺炎的多肽是一種環狀的14肽；臨床上常用的催產素是一種多肽；已獲廣泛應用的白蛋白多肽、胸腺肽、血清胸腺因子（FTS）等均可以引起免疫T細胞的分化；近日來在中國及日本已開始使用的糖肽輔助治療腫瘤，其作用機理是使淋巴系統活化等等。應用多肽技術開發的醫用蛋白質芯片（肽芯片）只有指甲蓋大小，放置了與腎炎、胃潰瘍和胃癌等相關的抗原分子，只要通過芯片閱讀儀便可檢測到有關疾病的功能狀態與變異情況。其功能已相當于一個大型或中

3、型實驗室、化驗室，效率是傳統醫學檢測的成百上千倍，受檢者幾乎沒有任何痛苦。肽芯片的廣泛應用，已在醫學臨床檢測業引發一場技術革命。自從1963年MERRIFIELD發展成功了固相多肽合成（SPPS）方法以來，經過不斷的改進和完善，到今天這個方法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點。伴隨著分子生學物、生物化學技術的飛速發展，多肽研究取得了驚人的、劃時代的飛躍。人們發現存在于生物體的多肽有數萬種，并且發現所有的細胞均能合成多肽。同時，幾乎所有的細胞也都受多肽調節，它涉及激素、神經、細胞生長與生殖等各個領域，21世紀是一個多肽的世界，人們研究多肽，也渴望著將多肽

4、應用到醫療、保健、檢測等多個領域中去，為人類造福。固相合成的主要設計思想是：先將所要合成肽鏈的羧末端氨基酸的羧基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應接長肽鏈。這樣的步驟可以重復的多次進行下去，即縮合洗滌去保護中和和洗滌下一輪縮合，最后達到所需要合成的肽鏈長度。目前合成多肽的方法主要有液相合成法和固相合成法。在液相肽合成中，每次接肽以后都需要對產物分離純化或結晶以便除去未反應的原料和副產物。這個步驟相當費時間而且麻煩，因操作帶來的損失往往也很大。為了減少這個麻煩并期望能夠使接肽反應自動化，麥瑞菲爾德（

5、Merrifield）于1963年發展成功了固相肽合成方法，他用這個方法獲得了結晶的LeuAlaGlyVal四肽。與之差不多同時，勒辛格（Letsinger）和柯爾內特（Kornet）也用固相載體經不同的化學途徑合成了LeuGly。以后又經過麥瑞菲爾德本人以及其它實驗室對這個方法進行不斷的改進和完善，使之到今天已經成為多肽和蛋白質合成中的一個常用的技術。為此麥瑞菲爾德獲得了1984年諾貝爾化學獎。固相合成的基本原理多肽合成是一個重復添加氨基酸的過程，合成一般從C端（羧基端）向N端（氨基端）合成。過去的多肽合成是在溶液中進行的，但自從1963年Merrifield發展成功了固相多肽合成方法以來，

6、經過不斷的改進和完善，到今天固相法已成為多肽和蛋白質合成中的一個常用技術，表現出了經典液相合成法無法比擬的優點。其基本原理是：先將所要合成肽鏈的羥末端氨基酸的羥基以共價鍵的結構同一個不溶性的高分子樹脂相連，然后以此結合在固相載體上的氨基酸作為氨基組份經過脫去氨基保護基并同過量的活化羧基組分反應，接長肽鏈。重復（縮合洗滌去保護中和和洗滌下一輪縮合）操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，經過純化等處理，即得所要的多肽。其中-氨基用BOC（叔丁氧羰基）保護的稱為BOC固相合成法，-氨基用FMOC（9-芴甲氧羰基）保護的稱為FMOC固相合成法。條件選擇將固相合成與其他技術分開來的最

7、主要的特征是固相載體，能用于多肽合成的固相載體必須滿足如下要求：必須包含反應位點（或反應基團），以使肽鏈連在這些位點上，并在以后除去；必須對合成過程中的物理和化學條件穩定；載體必須允許在不斷增長的肽鏈和試劑之間快速的、不受阻礙的接觸；另外，載體必須允許提供足夠的連接點，以使每單位體積的載體給出有用產量的肽，并且必須盡量減少被載體束縛的肽鏈之間的相互作用。用于固相法合成多肽的高分子載體主要有三類：聚苯乙烯-苯二乙烯交聯樹脂、聚丙烯酰胺、聚乙烯-乙二醇類樹脂及衍生物，這些樹脂只有導入反應基團，才能直接連上（第一個）氨基酸。根據所導入反應基團的不同，又把這些樹脂及樹脂衍生物分為氯甲基樹脂、羧基樹脂、

8、氨基樹脂或酰肼型樹脂。BOC合成法通常選擇氯甲基樹脂，如Merrifield樹脂；FMOC合成法通常選擇羧基樹脂如王氏樹脂。氨基酸的固定主要是通過保護氨基酸的羧基同樹脂的反應基團之間形成的共價鍵來實現的，形成共價鍵的方法有多種：氯甲基樹脂，通常先制得保護氨基酸的四甲銨鹽或鈉鹽、鉀鹽、銫鹽，然后在適當溫度下，直接同樹脂反應或在合適的有機溶劑如二氧六環、DMF或DMSO中反應；羧基樹脂，則通常加入適當的縮合劑如DCC或羧基二咪唑，使被保護氨基酸與樹脂形成共酯以完成氨基酸的固定；氨基樹脂或酰肼型樹脂，卻是加入適當的縮合劑如DCC后，通過保護氨基酸與樹脂之間形成的酰胺鍵來完成氨基酸的固定。保護脫除要成

9、功合成具有特定的氨基酸順序的多肽，需要對暫不參與形成酰胺鍵的氨基和羧基加以保護，同時對氨基酸側鏈上的活性基因也要保護，反應完成后再將保護基因除去。同液相合成一樣，固相合成中多采用烷氧羰基類型作為氨基的保護基，因為這樣不易發生消旋。最早是用芐氧羰基，由于它需要較強的酸解條件才能脫除，所以后來改為叔丁氧羰基（BOC）保護，用TFA（三氟乙酸）脫保護，但不適用含有色氨酸等對酸不穩定的肽類的合成。1978年，chang Meienlofer和Atherton等人采用Carpino報道的Fmoc(9-芴甲氧羰基)作為氨基保護基，Fmoc基對酸很穩定，但能用哌啶-CH2CL2或哌啶-DMF脫去，近年來，F

10、moc合成法得到了廣泛的應用。羧基通常用形成酯基的方法進行保護。甲酯和乙酯是逐步合成中保護羧基的常用方法，可通過皂化除去或轉變為肼以便用于片斷組合；叔丁酯在酸性條件下除去；芐酯常用催化氫化除去。對于合成含有半胱氨酸、組氨酸、精氨酸等帶側鏈功能基的氨基酸的肽來說，為了避免由于側鏈功能團所帶來的副反應，一般也需要用適當的保護基將側鏈基團暫時保護起來。保護基的選擇既要保證側鏈基團不參與形成酰胺的反應，又要保證在肽合成過程中不受破壞，同時又要保證在最后肽鏈裂解時能被除去。如用三苯甲基保護半胱氨酸的S-，用酸或銀鹽、汞鹽除去；組氨酸的咪唑環用2,2,2-三氟-1-芐氧羰基和2,2,2-三氟-1-叔丁氧羰

11、基乙基保護，可通過催化氫化或冷的三氟乙酸脫去。精氨酸用金剛烷氧羰基（Adoc）保護，用冷的三氟乙酸脫去。固相中的接肽反應原理與液相中的基本一致，將兩個相應的氨基被保護的及羧基被保護的氨基酸放在溶液內并不形成肽鍵，要形成酰胺鍵，經常用的手段是將羧基活化，變成混合酸酐、活潑酯、酰氯或用強的失去劑（如碳二亞氨）形成對稱酸酐等方法來形成酰胺鍵。其中選用DCC、HOBT或HOBT/DCC的對稱酸酐法、活化酯法接肽應用最廣。 裂解及合成肽鏈的純化 BOC法用TFA HF裂解和脫側鏈保護基，FMOC法直接用TFA，有時根據條件不同，其它堿、光解、氟離子和氫解等脫保護方法也被采用。合成肽鏈進一步的精制、分離與

12、純化通常采用高效液相色譜、親和層析、毛細管電泳等。 HPLC分析純化分析HPLC使用柱子和泵系統，可以經受傳遞高壓，這樣可以用極細的微粒（3-10 m）做填料。由此多肽要在幾分鐘內高度被分析。HPLC分兩類：離子交換和反相。 離子交換HPLC依靠多肽和固相間的直接電荷相互作用。柱子在一定PH范圍帶有特定電荷衍變成一種離子體，而多肽或多肽混合物，由其氨基酸組成表現出相反電荷。分離是一種電荷相互作用，通過可變PH， 離子強度， 或兩者洗脫出多肽，通常， 先用低離子強度的溶液，以后逐漸加強或一步一步加強，直到多肽火柱中洗脫出。離子交換分離的一個例子使用強陽離子交換柱。如sulfoethylaspar

13、timide通過酸性PH中帶正電來分離。反相HPLC條件與正常層析正相反。多肽通過疏水作用連到柱上，用降低離子強度洗脫， 如增加洗脫劑的疏水性。通常柱子由共價吸附到硅上的碳氫烷鏈構成，這種鏈長度為G4-G8碳原子。 由于洗脫是一種疏水作用。大的疏水肽用短鏈柱洗脫好。 然而，總體實踐中， 這兩類柱互變無多少顯著差別，別類載體由碳水化合物構成， 比如苯基。典型的操作常由兩綬沖劑組成，0.1%TFA-H2o和80% acetonitrile 0.1%TFA-H2o稀acetonitrile。用線型梯變以每分鐘0.5%到1.0%改變的速度混合。常見分析和純化用柱為4.6×250mm(3-10 m)和22×250mm(10 m). 如果用徑向填柱，那么大小是8×100（3-10 m）和25×250mm(10 m)。大量各種緩沖劑含許多不同試劑，比如heptafluorobutyric酸，0.1%磷酸， 稀He formic酸(5-6%, pH2-4), 10-100mM NH4HCO3, 醋酸鈉/氨，TFA/TEA，磷酸鈉或鉀，異戊酚。這樣許多不同組合可形成緩沖劑，但要注意一點：硅反相柱料不能長