1、甜菜堿選擇性開放鈣離子通道升高小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣濃度研究基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（30400352）；教育部重點(diǎn)項(xiàng)目（205045）；黑龍江省自然科學(xué)基金（D200611）；黑龍江省研究生創(chuàng)新基金（YJSCX2006-0077HSD）作者簡(jiǎn)介：季宇彬(1956-)，男，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向?yàn)槟[瘤藥理學(xué)的研究。季宇彬1,2，馮小燕1,2，高世勇1,21.哈爾濱商業(yè)大學(xué)生命科學(xué)與環(huán)境科學(xué)研究中心藥物研究所博士后科研工作站，哈爾濱150076；2.國(guó)家教育部抗腫瘤天然藥物工程研究中心，哈爾濱150076）摘要：研究甜菜堿對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化及相關(guān)鈣通道的研究。應(yīng)用激光共聚焦

2、顯微鏡(LSCM)測(cè)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的變化，應(yīng)用不同鈣通道阻滯劑研究甜菜堿影響細(xì)胞內(nèi)鈣濃度變化途徑。對(duì)終濃度4mM甜菜堿作用淋巴細(xì)胞不同時(shí)間的細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度值分析表明：甜菜堿可以使淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度升高，6h后效果最明顯；對(duì)加入不同阻滯劑細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度變化分析表明：鈣通道及蛋白阻滯劑硝苯地平、地爾硫卓、咪貝地爾、金雀異黃素對(duì)甜菜堿升高淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒有影響；維拉帕米、新霉素、肝素、普魯卡因能阻斷甜菜堿對(duì)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高作用。由此可知：細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度升高主要通過以下途徑：（1）在G蛋白介導(dǎo)下通過影響L-型電壓門控鈣通道的1亞單位而引起外鈣內(nèi)流；（2）通過影響胞內(nèi)鈣庫

3、的IP3R鈣通道和RyR鈣通道而引起內(nèi)鈣外排。其共同引起胞質(zhì)鈣離子濃度增加。關(guān)鍵詞：甜菜堿；細(xì)胞內(nèi)Ca2；鈣通道阻滯劑The Investigation of Calcium Channel of Betaine on Mouse Splen-lymphocytes proliferation in VitroJI yu-bin1,2, FENG xiao-yan1,2, GAO shi-yong1,2(1. Center of Research and Development on Life Sciences and Environmental Sciences, Harbin Univer

4、sity of Commerce. Harbin 150076, China. 2. Engineering Research Center of Natural Anticancer Drugs, Ministry of Education. Harbin 150076, China)Abstract: Objective To investigate the effects of Betaine on splen-lymphocytes intracellular Ca2 concentration and correlated calcium channel in vitro. To o

5、bserve the effects of the Betaine on the Ca2i by LSCM, the path of Ca2 entering into cell with different Ca2 channel blocker. Analyzing the intracellular Ca2i, betaine can increasing the intracellular Ca2i, and the best times is 6h; Analyzing the intracellular Ca2i with Ca2+ channel blocker, the res

6、ult is Nifedipine、 Diltiazem、 Mibefradil、 Genistein can not affect the role of betaine increasing lymphocytes intracellular Ca2i and Verapamil、Heparin、Neomyci-sulfate、Procaine can block the role of betaine increasing lymphocytes intracellular Ca2i. Betaine can increasing intracellular Ca2i. and the

7、way of increasing intracellular Ca2i as following:(1)It can influence the 1-subunit of L-VDC which is affected with G-protein. (2)It can increasing intracellular Ca2i through influencing IP3R Ca2 channel and RyR Ca2 channel.Key words: Betaine；intracellular Ca2；Ca2+ channel blocker甜菜堿是一種季氨型生物堿，又名甘氨酸甜

8、菜堿、三甲基甘氨酸等，化學(xué)名稱為N-N-N-三甲基甘氨酸內(nèi)鹽，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與氨基酸、膽堿相似。甜菜堿本身是動(dòng)物體內(nèi)的代謝中間產(chǎn)物，經(jīng)大量試驗(yàn)證明，甜菜堿及其鹽類無毒、無害、無污染1，其小鼠半數(shù)致死量（LD50）在11000mg/kg，對(duì)動(dòng)物無致畸、致癌、致突變作用，是公認(rèn)的安全物質(zhì)2，且能促進(jìn)脂肪代謝，促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成3。免疫是高等生物體識(shí)別自身物質(zhì)和非自身物質(zhì)的能力，可以保護(hù)機(jī)體4。免疫系統(tǒng)由免疫器官，免疫細(xì)胞和免疫分子組成。淋巴細(xì)胞（lymphocyte）是免疫系統(tǒng)中較重要的細(xì)胞，在免疫應(yīng)答中起關(guān)鍵作用5，有關(guān)報(bào)道指出甜菜堿有增強(qiáng)機(jī)體免疫的作用。T淋巴細(xì)胞激活的途徑有多種，其早期變化的重要現(xiàn)

9、象之一就是細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的增加6。同樣B細(xì)胞活化所發(fā)生的早期變化之一也是細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度的升高7。因此，測(cè)定甜菜堿作用下淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化對(duì)研究甜菜堿免疫調(diào)節(jié)作用的機(jī)制具有十分重要的意義。本文主要從Ca2+通路研究甜菜堿對(duì)淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子的影響。 1 試驗(yàn)材料1.1實(shí)驗(yàn)儀器CO2培養(yǎng)箱（日本三洋公司）；激光共聚焦顯微鏡（德國(guó)Leica公司）； Olympus IX70倒置顯微鏡（Olympus公司）；電子天平（Ohaus公司）；Bio-680型酶標(biāo)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；Gilson移液器（France）1.3實(shí)驗(yàn)藥品與主要試劑甜菜堿（浙江綠成生物技術(shù)有限公司）；Co

10、nA（美國(guó)Sigma公司）；胎牛血清（Hyclone公司）；RPMI-1640（GIBCO公司）； Fluo-3/AM（Sigma公司）；硝苯地平（Nifedipine）（Sigma公司）；地爾硫卓（Diltiazem）（Sigma公司）；維拉帕米（Verapamil）（Sigma公司）；咪貝地爾（Mibefradil）（Sigma公司）；金雀異黃素（Genistein）（Sigma公司）；肝素(Heparin)（Sigma-Aldrich公司）；新霉素（Neomyci-sulfate）（Sigma-Aldrich公司）；普魯卡因（Procaine）（Sigma公司）；皂素（Saponin）（

11、Fluka公司）。1.3實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠：兼用，體重(20±2.0)，由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所提供，2試驗(yàn)方法 2.1甜菜堿對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度的影響以頸椎脫臼法處死小鼠, 用 75乙醇浸泡小鼠15min，沿腹腔中線剪開小鼠胸腔，取出脾臟置于培養(yǎng)皿中，剪去脂肪和筋膜組織，用RPMI1640培養(yǎng)液漂洗，用注射器芯輕輕擠壓，用200目尼龍網(wǎng)過濾到玻璃離心管中，無菌PBS，1500 rpm離心5 min洗滌細(xì)胞兩次，加入0.83的氯化胺到洗過的細(xì)胞中，靜置5min,以除去血紅細(xì)胞，用RPMI1640培養(yǎng)液離心洗滌細(xì)胞兩次，以除去剩余的氯化胺，將上述收集到的脾臟細(xì)胞置

12、于玻璃培養(yǎng)瓶中，在 37，5% CO2培養(yǎng)箱中靜止培養(yǎng)24h，以除去貼壁細(xì)胞，收集未貼壁的細(xì)胞懸液即獲得脾淋巴細(xì)胞。計(jì)數(shù)接種培養(yǎng)，臺(tái)盼藍(lán)染色計(jì)數(shù)，活細(xì)胞數(shù)大于95。取小鼠脾淋巴細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107個(gè)mL，以1ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板上，加入甜菜堿使其終濃度為4mM，設(shè)RPMI-1640培養(yǎng)基為陰性對(duì)照組。于0h、2h、6h、12h、18h收集細(xì)胞。Fluo-3/AM熒光標(biāo)記：用無鈣臺(tái)氏液離心洗滌兩遍，用1倍體積的6×10-3mM的Fluo-3/AM與細(xì)胞懸液混合，細(xì)胞與此混合物37下孵育30min。激光共聚焦掃描顯微鏡檢測(cè)，將標(biāo)記后的細(xì)胞用激光共聚焦掃描顯微

13、鏡對(duì)其進(jìn)行掃描觀察，用488nm波長(zhǎng)的激光作為激發(fā)波長(zhǎng)，515nm處探測(cè)熒光發(fā)射，用Leica confocal software lite version 軟件對(duì)掃描圖像進(jìn)行分析。每組均重復(fù)三次2.2小鼠脾淋巴細(xì)胞相關(guān)通道及蛋白抑制劑對(duì)甜菜堿升高細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響取小鼠脾淋巴細(xì)胞，方法同上。調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×107個(gè)mL，以1ml/孔接種于24孔培養(yǎng)板上。共分兩大組，第一組(RPMI-1640組)：各孔分別加入鈣通道阻滯劑：硝苯地平（Nifedipine）、地爾硫卓（Diltiazem）、維拉帕米（Verapamil）、咪貝地爾（Mibefradil）、金雀異黃素（Gen

14、istein）、肝素(Heparin)、新霉素（Neomyci-sulfate）、普魯卡因（Procaine）及陰性對(duì)照RPMI-1640各0.5ml，在 37oC 條件下孵育 20 分鐘后，加入RPMI-1640（1ml/孔），使各阻滯劑終濃度分別為2×10-3mM、1×10-3mM、5×10-3mM、2×10-3mM、5×10-3mM、1×10-3mM、1×10-3mM、0.5mM；第二組（甜菜堿組）：各孔分別加入硝苯地平、地爾硫卓、維拉帕米、咪貝地爾、金雀異黃素、新霉素、肝素、普魯卡因及對(duì)照組RPMI-1640在 37

15、oC 條件下孵育 20 分鐘后，加入甜菜堿使其終濃度為 4mM，此時(shí)各阻斷劑終濃度與第一組相同。培養(yǎng)6h后收集細(xì)胞，用Fluo-3/AM熒光標(biāo)記，用激光共聚焦對(duì)其進(jìn)行掃描，方法同上。每組均重復(fù)三次。其中硝苯地平、地爾硫卓、維拉帕米是細(xì)胞膜 L-型電壓門控鈣通道阻斷劑，它們分別與L-型鈣通道的三個(gè)獨(dú)立位點(diǎn)相結(jié)合，具有藥理學(xué)配體和受體結(jié)合的特性；咪貝地爾是細(xì)胞膜T-型電壓門控鈣通道阻斷劑；金雀異黃素是酪氨酸蛋白激酶抑制劑，可抑制激酶的磷酸化位點(diǎn)，抑制包括自身磷酸化在內(nèi)的磷酸化；肝素是三磷酸肌醇受體拮抗劑；新霉素是磷脂酶 C（PLC）的抑制劑，它可阻斷由 PLC催化的磷脂肌醇代謝，從而抑制 IP3的

16、生成；普魯卡因是胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) ryanodine 受體鈣通道的阻斷劑。2.4統(tǒng)計(jì)分析用SPSS13.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。3實(shí)驗(yàn)結(jié)果 3.1甜菜堿對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度的影響加入甜菜堿不用時(shí)間后，淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度與同期對(duì)照組相比顯著升高。其中加藥6h后最高，12h后有所下降。（見Table1，F(xiàn)ig1）Table1 Influence of Betaine on intracellular Ca2+i of mouse splen-lymphocytes（±，n=20）TimeControlBetaine2h6h12h18h31.80±4.0932.63&#

17、177;9.1131.65±3.4832.43±2.4034.09±7.6346.84±7.88*37.91±4.63*37.76±4.44*p<0.05 vs control , *p<0.01 vs control 3.2小鼠脾淋巴細(xì)胞相關(guān)通道及蛋白抑制劑對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的影響RPMI 1640組加入阻斷劑后鈣離子濃度與其相應(yīng)的空白對(duì)照相比均無變化，說明各通道蛋白阻滯劑對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞本身鈣離子濃度沒有影響。甜菜堿組加入不同阻斷劑后鈣離子濃度與其相應(yīng)的空白對(duì)照比較，其中硝苯地平、地爾硫卓、咪貝地爾、金雀異黃素對(duì)甜菜

18、堿誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒有影響，而維拉帕米、肝素、新霉素、普魯卡因能顯著抑制甜菜堿誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子升高的作用。相同條件下，甜菜堿組的空白對(duì)照與RPMI 1640組的空白對(duì)照相比有顯著性差異，與前面所做的甜菜堿能升高淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相符，說明該實(shí)驗(yàn)可行。(見Table2)Table2 Influence of correlated path and proteo-inhibitor on Ca2+ of mouse splen-lymphocytes（±，n=20）blockersRPMI 1640BetaineControlNifedipine Diltia

19、zemVerapamil MibefradilGenisteinHeparinNeomycin sulfateProcaine32.02±6.3332.20±4.7632.01±3.8830.94±3.9831.83±3.0030.97±3.7632.05±4.1631.68±4.9231.83±3.87 46.51±7.6846.61±8.87 46.70±9.2931.31±5.07*43.74±8.05 42.95±4.39 30.64&#

20、177;5.03* 32.50±4.38* 31.57±5.03*p<0.05, *p<0.01 vs Betaine controlp<0.05, p<0.01 vs RPMI1640 control4討論 細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的升高，是淋巴細(xì)胞激活和增殖中早期呈現(xiàn)的一個(gè)重要現(xiàn)象。細(xì)胞內(nèi)游離Ca2 +濃度的改變是細(xì)胞生理功能的重要物質(zhì)基礎(chǔ),也是多種受體激動(dòng)后信號(hào)傳遞過程中的中心環(huán)節(jié)8。本文用激光共聚焦顯微鏡掃描，觀察到不同時(shí)間的淋巴細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度都明顯高于同期的對(duì)照組，表明Ca2在加甜菜堿2h后就對(duì)淋巴細(xì)胞增殖進(jìn)行調(diào)控，且6h后達(dá)到最大值，之后Ca

21、2濃度反而下降，可能原因是淋巴細(xì)胞處于分裂、增殖狀態(tài)，這就使細(xì)胞所處的生長(zhǎng)周期不同，所表達(dá)的鈣通道數(shù)量不同，細(xì)胞內(nèi)Ca2濃度增加程度也就不同。鈣離子作為細(xì)胞信使的基礎(chǔ)，調(diào)控著細(xì)胞的生理作用9。細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的變化受鈣離子通道的影響，目前已知的鈣通道種類較多，主要分為：電壓門控鈣通道（VDC）、受體操控性鈣通道（ROC）、機(jī)械操縱性鈣通道和鈣庫調(diào)控性鈣通道（SOC）。電壓門控鈣通道主要受控于膜電壓的變化，但也能被神經(jīng)遞質(zhì)、G蛋白、信使依賴激酶所調(diào)控，主要存在于可興奮性細(xì)胞10。電壓門控通道又分為四種：L、T、N和P型。L型和T型廣泛存在于各種細(xì)胞，N和P型存在于神經(jīng)細(xì)胞。細(xì)胞中的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有很強(qiáng)的

22、Ca2攝入能力，所以普遍認(rèn)為是胞內(nèi)主要鈣庫。L型鈣通道是鑲鉗在細(xì)胞膜雙脂質(zhì)層中的糖蛋白復(fù)合體，是一種multimeric蛋白質(zhì)，主要由1、2 3個(gè)亞單位組成，亞單位附著于2亞單位上，其中1是L型鈣通道的主要功能亞單位，和2為輔助性亞單位。至今發(fā)現(xiàn)的L型鈣通道拮抗劑至少有3類：(1) 雙氫吡啶類，如硝苯地平；(2) 苯噻氮卓類，如地爾硫卓；(3) 苯烷胺類，如維拉帕米。L型鈣通道三種阻斷劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)不同，與鈣通道結(jié)合的位點(diǎn)也不同，其中已明確表明維拉帕米是1亞單位的阻斷劑。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，硝苯地平和地爾硫卓對(duì)甜菜堿升高淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度沒有影響，而維拉帕米能抑制甜菜堿引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高。可知，甜

23、菜堿使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度增加與影響L型鈣通道的1亞單位有關(guān)。而咪貝地爾是細(xì)胞膜 T-型電壓門控鈣通道阻斷劑，其對(duì)甜菜堿誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高沒有影響，說明甜菜堿升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度不是通過激活T-型電壓門控鈣通道。金雀異黃素是酪氨酸蛋白激酶抑制劑，而新霉素是磷脂酶 C（PLC）的抑制劑11。金雀異黃素對(duì)甜菜堿誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高沒有影響，而新霉素能抑制甜菜堿誘導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)鈣升高。說明細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高是通過G蛋白- PLC- IP3這條途徑，而不是通過激活酪氨酸蛋白激酶而起作用。由此可知：甜菜堿升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的途徑之一是在G蛋白介導(dǎo)下通過影響L型鈣通道的1亞單位引起

24、外鈣內(nèi)流。淋巴細(xì)胞內(nèi)主要的鈣庫是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)， Ca2+通道通過不同的調(diào)節(jié)機(jī)制將ER內(nèi)的鈣離子釋放到細(xì)胞漿內(nèi)以發(fā)揮相應(yīng)的生物效應(yīng)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣通道主要有兩種：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜IP3受體（IP3R）鈣通道和ryanodine受體（RyR）鈣通道，廣泛存在于大多數(shù)細(xì)胞中。肝素是胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng) IP3R鈣通道阻斷劑，普魯卡因是RyR鈣通道阻斷劑，其均能抑制細(xì)胞內(nèi)甜菜堿誘導(dǎo)的鈣離子升高。說明甜菜堿升高淋巴細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的途徑之二是通過影響細(xì)胞內(nèi)IP3R鈣通道和RyR鈣通道，其共同作用引起胞質(zhì)鈣增加。肝素為水溶性物質(zhì)，不易被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞，實(shí)驗(yàn)時(shí)需先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行可通透性制備。本實(shí)驗(yàn)采用先用適宜濃度皂素（Saponin

25、）先孵育10min，之后在加肝素孵育20min。由以上實(shí)驗(yàn)表明，甜菜堿升高細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度主要通過以下途徑：（1）在G蛋白介導(dǎo)下通過影響L-型電壓門控鈣通道的1亞單位而引起外鈣內(nèi)流；（2）通過影響胞內(nèi)鈣庫的IP3R鈣通道和RyR鈣通道而引起內(nèi)鈣外排。其共同引起胞質(zhì)鈣離子濃度增加。參考文獻(xiàn)：1Atkinson W, Elmslie J, Lever M, et al. Dietary and supplementary betaine: acute effects on plasma betaine and homocysteine concentrations under standard a

26、nd postmethionine load conditions in healthy male subjectsJ.Am J Clin Nutr. 2008, 87(3):577-85.2Ji C,Kaplowitz N. Betaine decreases hyperhomocysteinemia, endoplasmic reticu- lum stress, and liver injury in alcohol-fed miceJ.Gastroenterology. 2003,124(5): 1488-99.3Kim SJ,Jung YS,Kwon do Y,et al. Alle

27、viation of acute ethanol-induced liver injury and impaired metabolomics of S-containing substances by betaine supplementationJ. Biochem Biophys Res Commun.2008, 18;368(4):893-8. 4Du Y,Jiang P,Li Y,et al. Immune responses of two recombinant adenoviruses expressing VP1 antigens of FMDV fused with porc

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