1、泛素化蛋白檢測方法LG GROUP system office room LG A16H-LG Y Y-LGU A8Q8-LG A162泛素化蛋白檢測方法蛋白質泛素化簡介蛋白質泛素化修飾過程在人體免疫系統調節過程中起到了關鍵性的作用。與磷酸化 修飾過程一樣，泛素化修飾過程也是一種可逆的共價修飾過程，它能夠調節被修飾蛋白 的穩定性、功能活性狀態以及細胞內定位等情況。泛素蛋白是一個由76個氨基酸殘基組成的非常保守的多肽，它能在El、E2、E3酶 等一系列酶促反應催化下與細胞內靶蛋白上的一個或多個賴氨酸殘基發生共價連接。泛 素蛋白本身也含有7個賴氨酸殘基，因此它們之間也可以通過這些位點互相連接，形成

2、 多泛素蛋白鏈（polyubiquitin chain） o目前研究顯示，如果多泛素蛋白鏈與被修飾 蛋白上的第48位賴氨酸殘基相連，會介導靶蛋白進入蛋白酶體而被降解；如果與被修 飾蛋白上其它位點，比如第63位賴氨酸殘基相連，則靶蛋白可以發揮信號通路功能而 不會被降解。與磷酸化修飾途徑一樣，泛素化修飾途徑也是可逆的，即可以通過去泛素化酶 （DUB）將泛素蛋白修飾物去除掉。靶蛋白經泛素化途徑修飾之后，連接在靶蛋白上的 泛素蛋白單體或多聚體可以被各種泛素蛋白結合結構域（UBD）所識別和結合。人類蛋 白質組中含有兩種E1酶、50種E2酶、600種E3酶、90種DUB酶和20種UBD,這說明 泛素修飾途

3、徑在細胞調控中起到了多么重要的作用。E3酶是泛素修飾途徑中決定底物特 異性的關鍵酶，它可以分為兩大類，即含有HECT結構域的E3酶和其它含有RING結構 域或RING樣結構域（比如U-box或PHD結構域）的E3酶。這兩種E3酶都在免疫調控 過程中起到了關鍵性的作用。蛋白質泛素化的檢測方法研究蛋白質的泛素化首先需要明確的三個基本點：哪些蛋白發生了泛素化；發生了 泛素化的蛋白質，具體是哪個位點的賴氨酸殘基發生了泛素化；進行定量。明確了上述幾點后，進一步需要弄清楚的是，我們感興趣的泛素化蛋白，是如何發 生泛素化的，影響這一泛素化過程的關鍵分子是什么？或者說這一過程中的E3酶是什 么？然后需要研究的

4、是，這一蛋白質發生泛素化之后可以產生那些分子效應對下游的信 號通路有什么影響研究上述內容的實驗方法和實驗流程:方法一：western blot and strip通過WB檢測所有發生泛素化的蛋白條帶，拍照后，將膜strip。然后與特定蛋白 的抗體和特定泛素化位點的抗體反應，顯色拍照。通過陽性條帶的對比來初步判 斷某一特定蛋白的特定位點發生了泛素化。【具體實驗流程附后】方法二：western blot and immunoprecipitations通過免疫共沉淀方法將某一特定蛋白以及與其結合的蛋白分離出來。分離出來的 蛋白再進行SDS電泳和western blot分析。【具體實驗流程附后】。這

5、一方法可 以明確具體哪個蛋白的哪個賴氨酸殘基發生了泛素化修飾。方法三：in vitro ubiquitination assay將要研究的目的基因轉染293細胞，使其大量表達。24h后提取并分離目的蛋 白。在體外反應buffer中將我們要研究的蛋白A （被泛素化的那個蛋白）與 UBE1, UbeH13-Uev 1 a heterodimer complex , HA-ubiquitin 以及我們要研究 的蛋白B （引起蛋白A泛素化的蛋白），共同進行孵育。將孵育后的產物進行IP 和WB分析。【具體實驗流程附后】。這一方法可以明確引起哪個蛋白是引起某蛋 白發生泛素化修飾的E3連接酶。方法四：in

6、vitro ubiquitin-binding assay將我們要研究的蛋白（被泛素化的蛋白）基因轉染293細胞，大量表達后提純。或者直接提取內源性蛋白。在體外與K63- or K48-linked ubiquitin chain petides孵育，然后通過SDS電泳并用泛素化抗體進行檢測。這一方法可以明確 要研究的蛋白哪個賴氨酸殘基容易發生泛素化。方法一：WB strip實驗流程提取組織/細胞的總使用總泛素化抗體檢測所有發生了泛素化 的蛋白（此時可以觀察到發生了泛素化的蛋白主用特定蛋白的抗 體與膜反應顯色用Ub K63抗體與膜反應顯色Merge如果總的泛素化蛋白的條帶，與特定蛋白的條帶，以及K63位點泛素化條帶發生了重合，此時可以初步推測，特定蛋白的第63位賴氨酸方法二：Western blot and immunoprecipitations提取組織/細胞總用瓊脂糖珠或磁珠包被的特異蛋白抗體，將與該蛋白結合的所有蛋白分離出來SDS電泳用泛素化抗體進行反應Stripping the用特異抗體進行反應方法三：in vitro ubiquitination assay將要研究的蛋白基因轉染293細胞使其大提取蛋白，通過免疫共沉淀方法分離目的將可能發生相互作用的兩種蛋白