1、小鼠幾丁質酶的重組表達和抗體制備        【摘要】  目的: 檢測脂多糖（LPS）刺激成骨細胞后, 幾丁質酶（chitotriosidase）基因表達變化情況。進行小鼠chitotriosidase的原核和真核表達, 并利用原核表達純化的蛋白, 制備兔抗鼠多克隆抗體。方法: 用LPS刺激MC3T3E1細胞, 提取mRNA, 通過RTPCR獲得小鼠chitotriosidase的編碼區全長序列, 克隆進pRSET A載體, 轉化BL21菌株, IPTG誘導表達。獲得的包涵體蛋白用鎳柱純化后, 作為抗原

2、免疫兔子, 制備多克隆抗體。用該抗體檢測真核表達的小鼠chitotriosidase蛋白, 并確定抗體的靈敏度和特異性。結果: LPS明顯刺激chitotriosidase表達。原核表達的包涵體蛋白經鎳柱純化后也能制備出效果較好的多克隆抗體。結論: 成功地克隆表達了小鼠的chitotriosidase蛋白, 并制備出高靈敏度、 高特異性的多克隆抗體, 為進一步闡明chitotriosidase在病理條件下的表達變化和功能提供了一條途徑。 【關鍵詞】  幾丁質酶; 脂多糖; 重組表達; 多克隆抗體    幾丁質酶（chitotriosidase）是一類特異

3、性水解幾丁質的蛋白。雖然在哺乳動物體內還沒有發現幾丁質, 研究人員已經在人、 大鼠等物種中克隆得到了chitotriosidase及幾個相關家族成員, 它們都屬于糖水解酶18家族。大量報導, chitotriosidase在很多與炎癥反應相關的疾病患者體內表達升高。在體外試驗中也已證明, IFN和TNF等炎癥性細胞因子能夠誘導chitotriosidase表達1, 2。但是, 該基因的功能目前尚不清楚。我們用脂多糖（lipopolysaccharide,  LPS）刺激成骨細胞株MC3T3E1, 發現chitotriosidase表達升高。我們從LPS刺激的細胞中提取RNA, 通過R

4、TPCR得到該基因的全長編碼序列, 并進行了該蛋白的原核和真核表達。以原核表達純化的蛋白為抗原, 制備抗體, 為今后研究該基因的表達調控機制和生物學功能打下了基礎。    1  材料和方法    1.1  材料  大腸桿菌BL21為本實驗室保存,  質粒pRSET A和 pcDNA3.1D 為Invitrogen公司產品。新西蘭大白兔(雄性,  質量250 kg)購自廣州中醫藥大學實驗動物中心; 各種限制性內切酶、 dNTP、  Taq DNA聚合酶和Pfu聚合酶購自TaKa

5、Ra公司;  轉染試劑Lipofectamine 2000,  TRIzol和逆轉錄試劑盒購自Invitrogen公司;  鎳柱, LPS, 完全弗氏佐劑和不完全弗氏佐劑購自Sigma公司;  DMEM為Gibco公司產品; 胎牛血清購自杭州四季青公司; 抗Histag抗體購自Merck公司; HRP偶聯的羊抗兔二抗,  增強化學發光(ECL)檢測試劑盒為KPL公司產品。蛋白定量試劑盒購自Biorad公司。引物合成和測序由上海英駿生物技術有限公司完成。小鼠來源的成骨細胞株MC3T3E1購自醫學院細胞中心, cos7細胞為本試驗室保存。 

6、;   1.2  方法    1.2.1  細胞培養和LPS刺激細胞方法  MC3T3E1細胞培養在DMEM（含100 mL/L FBS）, 置于37、 50 mL/L CO2溫箱中。待細胞達到90%匯合時, 接種6孔板。過夜后, 加入LPS至終濃度為10 mg/L。檢測chitotriosidase的表達變化的引物序列: 上游引物: 5GACCCTGTTAGCCGTTGG3, 下游引物: 5CTTGGAGTCTCGGATGGA3。PCR產物經測序證明序列正確。    1.2.2

7、60; 小鼠chitotriosidase編碼區全長序列的獲得和真核與原核表達質粒的構建  LPS刺激細胞6 h后, 棄去培養液, 直接加入1 mL TRIzol。然后按照說明書提取總RNA, 反轉錄得到cDNA。用PCR的方法獲得chitotriosidase編碼區的全長序列（不含信號肽）, 在引物的末端分別加入Xho 和EcoR 的酶切位點。引物序列為: 上游引物5GATCTCGAGGCAAAACTGGTCTGCTACCTC3, 下游引物5CTAGAATTCGCTCCAGGTACAACATTTGC3;  克隆到pRSET A載體, 命名為chpRSET。另外設計一對引物

8、, 在末端分別加入Xba 和Not 的酶切位點。引物序列為: 上游引物5ATGCGGCCGCATGGTGCAGTCCCTGGCCT3, 下游引物5CTATCTAGAGCTCCAGGTACAACATTTGC3,  克隆到pcDNA3.1D載體, 命名為chpcDNA。以上兩個載體經測序證明序列正確。    1.2.3  融合蛋白的表達、 純化和定量  把表達載體chpRSET轉化大腸桿菌BL21菌株, 經1 mmol/L IPTG誘導5 h,  超聲波裂解細胞, 離心收集包涵體。用8 mol/L尿素溶解包涵體。最后用鎳柱純化蛋

9、白。Biorad試劑盒測定蛋白濃度,  作為抗原免疫兔子。    1.2.4  抗體制備和鑒定  1 mL抗原(根據蛋白定量的結果約含抗原量300 g)與等體積完全弗氏佐劑(CFA)充分混合, 在白兔背部進行皮下注射。2周后, 等量抗原和不完全弗氏佐劑混勻, 同樣方法注射。以后每2周加強免疫1次。一共加強免疫3次。最后心臟取血制備抗血清。采用間接ELISA法檢測產生抗體的效價。    1.2.5  在真核細胞中瞬時表達  將chpcDNA3.1D質粒轉染cos7細胞,  以空

10、載體為對照。具體步驟為如下:  cos7細胞接種10 cm培養板,  使其24 h后生長達到80%匯合。將20 L Lipofectamine 2000和10 g質粒DNA分別與1 mL無血清培養基混合, 室溫靜置5 min。然后將兩者混合, 室溫靜置20 min, 逐滴加入培養板。培養48 h時收集細胞和上清進行重組蛋白表達檢測。    1.2.6  Western blot檢測  真核細胞轉染后的培養液上清和細胞裂解液各取20 L進行Western blot檢測。同時用自己制備的多克隆抗體和抗Histag的抗體檢測重組表

11、達蛋白是否表達并檢測多克隆抗體的靈敏度和特異性。蛋白樣品進行120 g/L的SDSPAGE電泳, 在69 V恒壓下1.5 h轉移到PVDF膜上, 5 0 g/L 脫脂奶粉室溫封閉2 h, TBST洗膜3次, 每次10 min, 加入以TBS稀釋的自己制備一抗和抗Histag的抗體（11 000）,  室溫結合2 h, TBST洗膜3次, 每次10 min。以TBS稀釋HRP標記的羊抗兔二抗（12 000）,  室溫孵育1 h,  TBST洗膜4次, 每次10 min, ECL法顯色鑒定, X膠片記錄結果。    2  結果&

12、#160;   2.1  LPS刺激細胞誘導chitotriosidase表達  LPS刺激MC3T3E1細胞, 在指定的時間收集RNA, 做RTPCR比較chitotriosidase表達變化情況。發現LPS刺激6 h后, 基因表達明顯升高（圖1）。1             2.2  表達載體的構建  將編碼區全長序列通過RTPCR方法得到。將用于原核表達的PCR產物和pRSET A載體用EcoR I和Xho I酶切后連接

13、; 將用于真核表達的PCR產物和pcDNA3.1D用Xba I和Not I酶切后連接。兩個表達載體經測序確定,  目的片段已正確插入。    2.3  Chitotriosidase在大腸桿菌中的表達、 純化和定量  200 mL菌液經IPTG誘導后,  在相對分子質量（Mr）約42 000處獲得大量的重組蛋白(圖2) ,  經超聲波裂解細胞, 離心后分別取上清和沉淀跑SDSPAGE電泳。發現該蛋白絕大部分位于包涵體中(圖3)。包涵體用8 mol/L尿素溶解后用鎳柱純化。通過蛋白定量, 確定濃度約為0.3 g/L,

14、  每次免疫家兔所用蛋白抗原量約為0.3 mg。    2.4  多克隆抗體鑒定  取抗血清,  用間接ELISA測定抗體的效價。結果顯示,  抗血清中抗體效價的滴度達113 000以上。以11 000稀釋的抗血清和抗Histag的抗體為一抗,  用Western blot檢測真核表達上清中的蛋白。抗血清與抗Histag的抗體在同一位置檢測到單一的條帶。這說明, 用鎳柱純化得到的未復性蛋白可以直接作為抗原免疫兔子,  得到靈敏度和特異性較好的抗體(圖4)。另外, 培養液上清中的蛋白含量遠大于細胞

15、裂解液中的含量(圖5)。根據報道人的chitotriosidase是一個分泌蛋白3。我們的Western blot結果在小鼠中驗證了這一結論。3  討論    Chitotriosidase是哺乳動物chitotriosidase家族成員。近年來研究人員陸續發現了該家族的多個成員,  包括chitotriosidase, 酸性chitotriosidase, YKL40等。研究表明哺乳動物chitotriosidase家族基因可能是機體應對不利環境的一種應激反應, 對細胞和組織起保護作用4, 5。尤其是chitotriosidase和YKL40

16、往往參與到組織重構和再生相關的病理過程中。例如, 動脈粥樣硬化, 肝纖維化, 肺纖維化和肉狀瘤病等患者的血清中, chitotriosidase濃度和活性都有明顯升高6, 7。值得注意的是, 這些病理過程都伴隨著炎癥反應的發生。另外, 體外實驗也證明, 細胞因子能夠誘導巨噬細胞表達chitotriosidase。因此, 現在普遍認為炎癥因子是刺激chitotriosidase表達的一個重要誘因。    我們的試驗證明, LPS刺激成骨細胞后能夠引起chitotriosidase表達升高。LPS是革蘭氏陰性菌細胞壁的重要成分, 也是細菌感染后引起炎癥反應的重要因子。

17、我們的結果暗示在骨組織感染或者炎癥條件下, chitotriosidase的表達可能會升高。目前對于該基因在生理和病理過程中的作用尚不清楚。我們推測它可能在骨髓炎, 骨關節炎等骨組織炎癥性疾病中起保護作用, 相關研究工作正在進行中。    以小鼠為模型研究基因功能有很多優勢。小鼠作為哺乳動物, 很多基因的功能與人有相同或相似之處; 可以在小鼠體內做很多無法在人身體上進行的試驗。因此, 我們制備的抗小鼠chitotriosidase抗體, 為將來在動物模型中研究chitotriosidase的表達情況和生物學功能提供了有利的工具, 也有助于進一步了解骨髓炎等骨科炎癥

18、性疾病的病理過程。【文獻】  1 Malaguarnera L, Musumeci M, Licata F, et al. Prolactin induces chitotriosidase gene expression in human monocytederived macrophagesJ. Immunol Lett, 2004, 94(25): 57-63.2 Di Rosa M, Musumeci M, Scuto A, et al. Effect of interferongamma, interleukin10, lipopolysaccharide and tumo

19、r necrosis factoralpha on chitotriosidase synthesis in human macrophagesJ. Clin Chem Lab Med, 2005, 43(17): 499-502.3 Renkema GH, Boot RG, Au FL, et al. Chitotriosidase, a chitinase, and the 39 kDa human cartilage glycoprotein, a chitinbinding lectin, are homologues of family 18 glycosyl hydrolases secreted by human macrophagesJ. Eur J Biochem, 1998, 251(2): 504-509.4 Hakala BE, White C, Recklies AD. Human cartilage gp39, a major secretory product of articular chondrocytes and synovial lining cells, is a mammalian m