1、細胞凋亡的細胞凋亡的DNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 細胞凋亡（細胞凋亡（apoptosis/programmed cell death） 細胞凋亡是為維持內環境穩定，一個由基因細胞凋亡是為維持內環境穩定，一個由基因控制的主動的有序的死亡過程，凋亡細胞將被吞控制的主動的有序的死亡過程，凋亡細胞將被吞噬細胞吞噬。噬細胞吞噬。生物學意義：生物學意義： 確保正常發育生長：清除多余的細胞確保正常發育生長：清除多余的細胞 維持內環境穩定：清除受損、突變、衰老的細胞維持內環境穩定：清除受損、突變、衰老的細胞 積極防御功能：對病毒感染細胞阻止復制積極防御功能：對病毒感染細胞阻止復制細胞凋亡過程中的形態學改

2、變細胞凋亡過程中的形態學改變 細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離。細胞體積縮小，連接消失，與周圍的細胞脫離。 細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞質密度增加，線粒體膜電位消失，通透性改變，釋放細胞色素細胞色素C到胞漿。到胞漿。 核質濃縮，核膜核仁破碎，核質濃縮，核膜核仁破碎，DNA降解成為約降解成為約180bp-200bp片片段。段。 凋亡小體形成。但無內容物外溢，因此不引起周圍的炎癥凋亡小體形成。但無內容物外溢，因此不引起周圍的炎癥反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。反應，凋亡小體可迅速被周圍專職或非專職吞噬細胞吞噬。 其中最重要和最具有特征性的改變是

3、其中最重要和最具有特征性的改變是Ca2+/Mg2+依賴性的核酸內切酶的激活而導依賴性的核酸內切酶的激活而導致染色質致染色質DNA在核小體連接部位斷裂，形成在核小體連接部位斷裂，形成以以180200 bp為最小單位的單體或寡聚體片為最小單位的單體或寡聚體片段。段。凋亡和壞死的區別凋亡和壞死的區別 壞死（壞死（necrosis）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素）：壞死是細胞受到強烈理化或生物因素作用引起細胞作用引起細胞無序變化無序變化的死亡過程。表現為細胞的死亡過程。表現為細胞 脹大，脹大，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，胞膜破裂，細胞內容物外溢，核變化較慢，DNA降解不充降解不充分，引起

4、局部嚴重的炎癥反應。分，引起局部嚴重的炎癥反應。 凋亡是細胞對環境的生理性病理性刺激信號，環境條件的凋亡是細胞對環境的生理性病理性刺激信號，環境條件的變化或緩和性損傷產生的應答變化或緩和性損傷產生的應答有序變化有序變化的死亡過程。其細的死亡過程。其細胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。胞及組織的變化與壞死有明顯的不同。凋亡和壞死的形態學特征凋亡和壞死的形態學特征凋凋 亡亡壞壞 死死單細胞或一小群細胞單細胞或一小群細胞相鄰的細胞團相鄰的細胞團細胞皺縮和卷積細胞皺縮和卷積細胞腫脹細胞腫脹核固縮和和碎裂核固縮和和碎裂核溶解核溶解完整的細胞膜完整的細胞膜破壞的細胞膜破壞的細胞膜細胞質保留在凋亡小體細胞質

5、保留在凋亡小體細胞質釋放細胞質釋放無炎癥無炎癥一般都存在炎癥一般都存在炎癥實驗原理實驗原理 本實驗是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺細胞本實驗是利用瓊脂糖凝膠電泳分析小鼠胸腺細胞DNA在地塞米松誘導下細胞的凋亡現象。凋亡細在地塞米松誘導下細胞的凋亡現象。凋亡細胞染色質胞染色質DNA在核小體連接處斷裂，形成在核小體連接處斷裂，形成180-200 bp或其整倍數的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表或其整倍數的寡核苷酸片段，在凝膠電泳上表現為梯狀電泳圖譜現為梯狀電泳圖譜(DNA ladder)，而壞死細胞或凋，而壞死細胞或凋亡后期的繼發性壞死細胞亡后期的繼發性壞死細胞DNA電泳后則成模糊的電泳后則成模糊的“

6、涂片狀涂片狀” 。材材 料料1. 凋亡細胞：經地塞米松誘導的小鼠胸腺細胞凋亡細胞：經地塞米松誘導的小鼠胸腺細胞2. 提取提取DNA：基因組：基因組DNA抽提試劑盒（抽提試劑盒（RNA酶、酶、蛋白酶蛋白酶K、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、懸浮液、裂解液、洗滌液、洗脫液、DNA ladder 標準品等）標準品等）3. DNA電泳：電泳：1 %的瓊脂糖凝膠、點樣緩沖液的瓊脂糖凝膠、點樣緩沖液4. 實驗器材：實驗器材：1.5mlEP管、吸附柱、收集管、臺式管、吸附柱、收集管、臺式高速離心機、高速離心機、65水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、水浴箱、瓊脂糖凝膠電泳裝置、紫外透射儀紫外透射儀 方方 法法一、胸

7、腺細胞的制備：一、胸腺細胞的制備： 小鼠摘眼球并斷椎處死，取胸腺，浸入含小鼠摘眼球并斷椎處死，取胸腺，浸入含510%小牛血清的小牛血清的1640培養液中，置銅網上研磨，培養液中，置銅網上研磨，將研磨好的細胞懸液用尼龍網過濾。將研磨好的細胞懸液用尼龍網過濾。2000rpm，離心離心5min，制成，制成1107細胞懸液備用。細胞懸液備用。二、提取胸腺細胞二、提取胸腺細胞DNA：裂解細胞階段（使用到的試劑：裂解液裂解細胞階段（使用到的試劑：裂解液=L液、液、RNaseA/蛋白酶蛋白酶K液液=A液）液） 將細胞離心后小心倒出液體，離心管中加入將細胞離心后小心倒出液體，離心管中加入100lL液和液和20

8、lA液，充分混勻，置于液，充分混勻，置于55溫浴溫浴20分鐘，其間來回顛倒離心管分鐘，其間來回顛倒離心管3-5次。次。(2) 結合結合DNA階段階段(使用到的試劑使用到的試劑: 結合緩沖液結合緩沖液=B液、液、3MNaAC, pH4.8) 加入加入10l 3MNaAC，隨后加入，隨后加入1250l B液，充分液，充分振蕩混合均勻（重要?。?，振蕩混合均勻（重要！），12000rpm離心離心3min。將上清分將上清分2次加入到離心吸附管。靜置次加入到離心吸附管。靜置1分鐘，分鐘，12000rpm離心離心30s，倒掉收集管中廢液。第二次，倒掉收集管中廢液。第二次同上，靜置同上，靜置1分鐘，離心分鐘，

9、離心30s。(3)漂洗階段（使用試劑：漂洗階段（使用試劑：600ul漂洗緩沖液漂洗緩沖液2=W液）液） 倒掉收集管中的廢液，再加入倒掉收集管中的廢液，再加入600ulW液，液，12000rpm離心離心30秒。秒。 重復上敘步驟，再次加入重復上敘步驟，再次加入600 ulW液，液，12000rpm離心離心30秒。秒。 倒掉廢液，再次倒掉廢液，再次12000rpm離心離心30秒。秒。(4) 洗脫收獲（使用試劑：洗脫收獲（使用試劑：50l洗脫緩沖液洗脫緩沖液=T液）液） 小心取出離心吸附柱（不可沾上小心取出離心吸附柱（不可沾上W液，因其中含液，因其中含有乙醇，會使提取有乙醇，會使提取DNA變性），將

10、其套入一個干變性），將其套入一個干凈的凈的1.5ml eppendorf管中，沿吸附柱的正中間小管中，沿吸附柱的正中間小心加入心加入50l T液，靜置液，靜置1分鐘后，于分鐘后，于12000rpm離心離心1min。Eppendorf管中便是收集到的基因組管中便是收集到的基因組DNA, 取取10l電泳。電泳。三、三、DNA瓊脂糖凝膠電泳：瓊脂糖凝膠電泳：(5)制板制板: 將將1 %的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取的瓊脂糖凝膠加熱溶化，取20ml倒倒板板, 待凝待凝, 取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液取梳。置板于電泳槽中，加電泳緩沖液至淹沒過膠。至淹沒過膠。(6) 加樣：取加樣：取50 uL DNA樣品

11、與樣品與10uL點樣緩沖液點樣緩沖液,混混勻勻, 10ul/孔。（孔。（DNA marker 直接加樣，直接加樣，5 ul/孔）?？祝?。(7) 電泳：點樣孔置負極，電壓電泳：點樣孔置負極，電壓80-100V，電泳至，電泳至溴酚蘭移出溴酚蘭移出2/3距離時，關閉電源。距離時，關閉電源。(8) 觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見綠觀察：取出凝膠板，置紫外透射儀上，可見綠色色DNA區帶。區帶。注意事項：注意事項：a 步驟步驟2中，加入中，加入B液后一定要充分混勻。離心后，液后一定要充分混勻。離心后，小心取出上清，小心取出上清，Tips頭不可吸附上白色沉淀（為頭不可吸附上白色沉淀（為基因組蛋白）。

12、基因組蛋白）。b 漂洗階段（步驟漂洗階段（步驟3）一定要離心充分去除漂洗緩）一定要離心充分去除漂洗緩沖液，可適當將離心時間延長。沖液，可適當將離心時間延長。c 洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。洗脫緩沖液一定要保證加入到吸附柱中央。結果觀察結果觀察 加地塞米松培養的胸腺細胞加地塞米松培養的胸腺細胞DNA電泳后呈典型電泳后呈典型的的“階梯狀階梯狀”條帶。未加地塞米松培養的胸腺條帶。未加地塞米松培養的胸腺細胞，細胞，DNA無類似改變。細胞壞死對照的無類似改變。細胞壞死對照的DNA電泳呈現彌漫的片狀圖譜。電泳呈現彌漫的片狀圖譜。地塞米松誘導小鼠胸腺地塞米松誘導小鼠胸腺細胞凋亡細胞凋亡1： DNA

13、 marker;2-3：細胞壞死對照：細胞壞死對照4-6：細胞凋亡；：細胞凋亡；7： 正常細胞對照正常細胞對照基因組基因組DNADNA抽提試劑盒抽提試劑盒SDS（十二烷基硫酸鈉）：破細胞膜、核膜，使組織蛋白與（十二烷基硫酸鈉）：破細胞膜、核膜，使組織蛋白與DNA分離分離EDTA（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制（乙二胺四乙酸二鈉）：抑制DNA酶活性，確保目的酶活性，確保目的DNA不再降解不再降解Proteinase K：使染色質上蛋白質與：使染色質上蛋白質與DNA分離，并進一步降解為分離，并進一步降解為小肽小肽/氨基酸氨基酸酚、氯仿：抽提除去蛋白質酚、氯仿：抽提除去蛋白質異丙醇：沉淀異丙醇：沉淀DNA

14、Goldview：DNA螢光染料，與螢光染料，與DNA結合形成一種光絡合物，在紫結合形成一種光絡合物，在紫外光下呈綠色螢光外光下呈綠色螢光TNF receptor-associated death domain (TRADD) Fas-associated death domain protein (FADD)cysteine-aspartic proteases（caspase）細胞凋亡的檢測細胞凋亡的檢測 細胞形態的改變細胞形態的改變 DNA片段片段 檢測檢測caspase，裂解的底物，調節因子和抑制因子，裂解的底物，調節因子和抑制因子 細胞膜的改變細胞膜的改變 線粒體改變線粒體改變細胞形

15、態的改變細胞形態的改變 電鏡檢測：電鏡檢測： 可檢測單個凋亡細胞的變化，但細胞凋亡早期可檢測單個凋亡細胞的變化，但細胞凋亡早期無明顯形態學變化的，需做其他實驗證實。無明顯形態學變化的，需做其他實驗證實。正常胸腺細胞正常胸腺細胞凋亡胸腺細胞凋亡胸腺細胞凋亡的淋巴細胞凋亡的淋巴細胞凋亡的淋巴細胞凋亡的淋巴細胞被巨噬細胞吞噬被巨噬細胞吞噬DNA片段的檢測片段的檢測 DNA瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖凝膠電泳 TUNEL法法（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling，TUNEL）：）：基本原理：存在于基本原理：存在于DNA上的切口

16、可被末端脫氧核苷酸轉移酶上的切口可被末端脫氧核苷酸轉移酶（TdT）識別，這種酶將催化）識別，這種酶將催化dUTP添加到切口上，添加到切口上，dUTP繼繼而可被其它標志物所標記。此法亦可用于標記遭到嚴重而可被其它標志物所標記。此法亦可用于標記遭到嚴重DNA損傷的細胞。損傷的細胞。TUNEL染色染色法展示出小鼠法展示出小鼠肝臟中的一個肝臟中的一個凋亡細胞凋亡細胞Caspase等凋亡相關因子檢測等凋亡相關因子檢測 western blot, immunoprecipitation Immunohistochemistry Apoptosis PCR microarray Apoptotic or a

17、nti-apoptotic regulator proteins such as Bax, Bid, and Bcl-2 can also be detected using fluorescence and confocal microscopy 檢測細胞膜的改變檢測細胞膜的改變 Annexin V基本原理：正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質基本原理：正常細胞中，磷脂酰絲氨酸只分布在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂酰絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。由脂膜內側翻向外側。Annexin V作為一種磷脂結合蛋白，作為一種磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷與磷脂酰絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此脂酰絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。線粒體的改變線粒體的改變 線粒體檢測：線粒體