1、分子熒光分析法Molecular fluorescence spectrophotometry一、概述一、概述1 光致發(fā)光光致發(fā)光： 當(dāng)某些物質(zhì)受到光的照射時(shí)，除吸收某種波長(zhǎng)的光之外還發(fā)射波長(zhǎng)相同或比吸收波長(zhǎng)更長(zhǎng)的光，這種現(xiàn)象叫光致發(fā)光。 熒光 fluorescence:物質(zhì)分子吸收光子能量而被激發(fā)，然后從激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)返回至基態(tài)時(shí)發(fā)射出的光。 磷光 phosphorescence:吸收光子 激發(fā) 三線(xiàn)態(tài)最低 振動(dòng)能級(jí) 基態(tài) 2 2 熒光分析方法熒光分析方法 Fluorometry 根據(jù)物質(zhì)的熒光譜線(xiàn)位置及其強(qiáng)度進(jìn)行 物質(zhì)鑒定和物質(zhì)含量測(cè)定的方法。 X射線(xiàn)熒光分析法 X-ray fluo

2、rometry 原子熒光分析法 atomic fluorometry 分子熒光分析法 molecular fluorometry 3. 3.優(yōu)點(diǎn)：優(yōu)點(diǎn)： 靈敏度高，選擇性好。mlgmlg/12101010/710熒光分析法檢出限為可見(jiàn)分光光度法檢出限紫外 二二 基本原理基本原理 1 1 有關(guān)概念有關(guān)概念 單線(xiàn)態(tài)單線(xiàn)態(tài)： 大多數(shù)分子含偶數(shù)個(gè)電子，成對(duì)地填充 在能量最低的各軌道中，根據(jù)Pauli不相 容原理，軌道中的兩個(gè)電子具有相反方 向的自旋，即自旋量子數(shù)為+1/2和-1/2， 其總自旋量子數(shù)為0。用2S+1表示電子 能態(tài)的多重性，基態(tài)所處的電子能態(tài)為 單線(xiàn)態(tài)。 當(dāng)基態(tài)分子的一個(gè)電子吸收光輻射被

3、激發(fā)而躍遷至較高的電子能級(jí)時(shí)，電子不發(fā)生自旋方向的改變，此時(shí)分子處于激發(fā)的單線(xiàn)態(tài)。激發(fā)三線(xiàn)態(tài)激發(fā)三線(xiàn)態(tài)： 電子在躍遷過(guò)程中自旋方向改變，分子具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，總自旋量子數(shù)為1，處于激發(fā)的三線(xiàn)態(tài)（2S+1=3）。2 2 基態(tài)、激發(fā)單線(xiàn)態(tài)、激發(fā)三線(xiàn)態(tài)比較 如圖所示，激發(fā)三線(xiàn)態(tài)和激發(fā)單線(xiàn)態(tài) 除電子自旋方向改變外，能量亦不相同。 E 基態(tài) 激發(fā)單線(xiàn)態(tài) 激發(fā)三線(xiàn)態(tài) 3 熒光的產(chǎn)生 熒光的產(chǎn)生過(guò)程： 基態(tài)吸收輻射 激發(fā)單線(xiàn)態(tài) 內(nèi)轉(zhuǎn)換、振動(dòng)馳豫 第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí) 發(fā)射熒光 基態(tài)的各振動(dòng)能級(jí)外轉(zhuǎn)換、振動(dòng)馳豫 基態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí) 熒光與磷光產(chǎn)生示意圖0V1V2V3V0V1V2V3V3V3V1

4、V1V2V2V0V0V0S1S2S1T內(nèi)轉(zhuǎn)換體系間跨越 發(fā)射熒光過(guò)程約為 ，返回基態(tài) 時(shí)，可停留在任一振動(dòng)能級(jí)上，因此，可得幾個(gè)非常靠近的熒光峰譜線(xiàn)。 有關(guān)概念：有關(guān)概念： 振動(dòng)弛豫：vbrational relexation 物質(zhì)分子被激發(fā)后，其電子可能躍遷到第一電子激發(fā)態(tài)或更高的電子激發(fā)態(tài)的幾個(gè)振動(dòng)能級(jí)上，在溶液中，激發(fā)態(tài)分子通過(guò)與溶劑分子碰撞而將部分振動(dòng)能量傳遞給溶劑分子，其電子則返回到同一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上，此過(guò)程稱(chēng)為。S710910 內(nèi)轉(zhuǎn)換：internal conversion 當(dāng)兩電子激發(fā)態(tài)之間能量相差較小以致其振動(dòng)能級(jí)有重疊時(shí)，受激分子將多余的能量轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮芏S遷至較低

5、電子能級(jí)。 熒光發(fā)射： 無(wú)論分子最初處于哪一個(gè)激發(fā)單線(xiàn)態(tài)，通過(guò)內(nèi)轉(zhuǎn)換及振動(dòng)弛豫，均可返回至第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)上，然后再以輻射形式發(fā)射光量子而返回到基態(tài)的任一振動(dòng)能級(jí)上，所發(fā)射的光量子即 稱(chēng)熒光熒光。 熒光的波長(zhǎng)總比激發(fā)光的波長(zhǎng)要長(zhǎng)? 外轉(zhuǎn)換：external conversion 如果分子在溶液中被激發(fā)，激發(fā)態(tài)分子與溶劑分子及其它溶質(zhì)分子之間相互碰撞而失去能量，以熱能形式放出，此過(guò)程稱(chēng)為外轉(zhuǎn)換。 通常發(fā)生在第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)或第一激發(fā)三線(xiàn)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)向基態(tài)轉(zhuǎn)換的過(guò)程中，會(huì)降低熒光或磷光強(qiáng)度。 體系間跨越：intersystem crossing 指處于激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)而使

6、分子的多重性發(fā)生變化的過(guò)程。如果第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)同激發(fā)三線(xiàn)態(tài)的最高振動(dòng)能級(jí)重疊，那么激發(fā)態(tài)分子的電子發(fā)生自旋反轉(zhuǎn)，分子由激發(fā)單線(xiàn)態(tài)跨越到激發(fā)三線(xiàn)態(tài)，熒光強(qiáng)度減弱或熄滅。 含有重原子如Br2、I2等的分子，體系間跨越最常見(jiàn)，因?yàn)殡娮拥淖孕c軌道運(yùn)動(dòng)之間的相互作用較大，有利于電子自反轉(zhuǎn)的發(fā)生。溶液中存在的氧分子等順磁性物質(zhì)也容易發(fā)生體系間跨越，從而使熒光減弱。 磷光發(fā)射： 激發(fā)單線(xiàn)態(tài)最低振動(dòng)能級(jí)體系間跨越激發(fā) 三線(xiàn)態(tài)高振動(dòng)能級(jí) 振動(dòng)馳豫 激發(fā)三線(xiàn)態(tài) 最低振動(dòng)能級(jí)（存活） 發(fā)射磷光 基態(tài) 各振動(dòng)能級(jí)振動(dòng)馳豫、外轉(zhuǎn)換基態(tài)最低振動(dòng)能級(jí) 與熒光比較：過(guò)程比熒光長(zhǎng)（ ） 磷光波長(zhǎng)較熒光長(zhǎng)?S10

7、104 綜上所述的能量釋放方式中： 輻射躍遷：熒光、磷光的發(fā)射。 無(wú)輻射躍遷：振動(dòng)弛豫、內(nèi)轉(zhuǎn)換、 外轉(zhuǎn)換、體系間跨越。三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜三、激發(fā)光譜與發(fā)射光譜1激發(fā)光譜激發(fā)光譜：excitaton spectrum 不同激發(fā)波長(zhǎng)的輻射引起物質(zhì)發(fā)射某一波長(zhǎng)熒光的相對(duì)效率。即固定熒光波長(zhǎng)，以熒光強(qiáng)度（F）為縱坐標(biāo)，激發(fā)波長(zhǎng)（ex）為橫坐標(biāo)作圖可得。2 發(fā)射光譜發(fā)射光譜：fluorescence spectrum 即熒光光譜，使激發(fā)光的波長(zhǎng)和強(qiáng)度保持不變，通過(guò)發(fā)射單色器掃描以檢測(cè)各種波長(zhǎng)下相應(yīng)的熒光強(qiáng)度，記錄熒光強(qiáng)度（F）對(duì)發(fā)射波長(zhǎng)（em）的關(guān)系曲線(xiàn)。 作用：鑒別熒光物質(zhì)； 選擇適當(dāng)?shù)臒晒鉁y(cè)定波

8、長(zhǎng)。 激發(fā)光譜和熒光光譜類(lèi)似“鏡像對(duì)稱(chēng)”關(guān)系 硫酸奎寧的激發(fā)光譜（虛線(xiàn)）及熒光光譜（實(shí)線(xiàn)）度強(qiáng)光熒nm300nm400nm500 3 溶液熒光光譜的特征A 斯托克斯位移：Stokes shift 1852年，Stokes首先觀(guān)察到：溶液熒光光譜中，熒光波長(zhǎng)總是大于激發(fā)光波長(zhǎng)。 原因原因：內(nèi)轉(zhuǎn)換、振動(dòng)馳豫達(dá)到第一激發(fā)單線(xiàn)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；激發(fā)態(tài)分子與溶劑相互作用；激發(fā)態(tài)分子返回到基態(tài)的各不同振動(dòng)能級(jí)，進(jìn)一步損失能量。B 熒光光譜的形狀與激發(fā)波長(zhǎng)無(wú)關(guān)：熒光發(fā)射通常發(fā)生于第一電子激發(fā)態(tài)的最低振動(dòng)能級(jí)；而與激發(fā)到哪一個(gè)電子激發(fā)態(tài)無(wú)關(guān)。四四 分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系分子結(jié)構(gòu)與熒光的關(guān)系 物質(zhì)能否產(chǎn)生熒光，主

9、要取決于物質(zhì)結(jié)構(gòu)及環(huán)境條件。1 物質(zhì)產(chǎn)生熒光的必要條件 物質(zhì)分子必須有強(qiáng)的紫外-可見(jiàn)吸收。 物質(zhì)必須具有較高的熒光效率。 熒光效率（fluorescence efficiency）又稱(chēng)熒光量子產(chǎn)率（fluorescence quantum yield） 吸收激發(fā)光的光子數(shù)發(fā)射熒光的光子數(shù) 任何物質(zhì)的 在01之間，如熒光素在水中 =0.65，蒽在乙醇中 =0.30，菲在乙醇中 =0.10。 熒光效率低的物質(zhì)雖有較強(qiáng)的紫外吸收，但所吸收的能量都以無(wú)輻射躍遷形式釋放，所以沒(méi)有熒光發(fā)射。 2 與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系 A A 長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)長(zhǎng)共軛結(jié)構(gòu)： 芳香環(huán)或雜環(huán)具有長(zhǎng)共軛的躍 *躍 遷，電子共軛程度越大，熒光

10、強(qiáng)度越大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。例：苯、萘、蒽的熒光強(qiáng)度比較。 205nm 286nm 356nm 278nm 321nm 404nm 0.11 0.29 0.36 B 分子的剛性和共平面性分子的剛性和共平面性 剛性：指分子自由旋轉(zhuǎn)程度的大小，若分子不能旋轉(zhuǎn)，則為剛性分子。 共平面性:指共扼電子的共平面程度。在長(zhǎng)共軛分子中，剛性和共平面性越大，熒光效率越大，熒光波長(zhǎng)長(zhǎng)移。exem 聯(lián)苯 芴C 取代基取代基： 增加分子的電子共軛程度的取代基,增強(qiáng)熒光，并使波長(zhǎng)長(zhǎng)移；減弱分子的電子共軛程度的取代基，使熒光減弱或熄滅。 第一類(lèi)基團(tuán)：-NH2、-OH、-OCH3、-CN等，屬于給電子基團(tuán)，增強(qiáng)熒光。 2 .

11、00 . 12Hc 第二類(lèi)基團(tuán)：-COOH、-NO2、-NO、-Cl -Br、 - I等，減弱分子的電子共軛性，使熒光減弱甚至熄滅。 第三類(lèi)基團(tuán)：-R、-SO3H等 對(duì)熒光的影響不明顯。五 影響熒光強(qiáng)度的外部因素影響熒光強(qiáng)度的外部因素1 溫度： 溫度越高，熒光效率及熒光強(qiáng)度越低。因?yàn)闇囟壬撸肿舆\(yùn)動(dòng)速度加快，分子間碰撞幾率增加，使無(wú)輻射躍遷增加，降低了熒光效率。 2 溶劑： 一般情況下，熒光波長(zhǎng)隨溶劑極性增大而長(zhǎng)移，強(qiáng)度也有所增加。 熒光強(qiáng)度隨溶劑粘度的減小而減弱。溶劑粘度減小時(shí)，可增加分子間碰撞機(jī)會(huì)，使無(wú)輻射躍遷增加而使熒光減弱。 若溶劑與熒光物質(zhì)形成化合物或溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)改變，

12、那么，熒光峰的波長(zhǎng)和熒光強(qiáng)度將發(fā)生變化。 3 pH的影響： 每種熒光物質(zhì)都有最適宜的pH范圍 如：苯胺在不同的pH下的熒光效率不同。 pH 2 pH712 pH13 無(wú)熒光 藍(lán)色熒光 無(wú)熒光4 熒光熄滅劑的影響： 熒光熄滅：指熒光物質(zhì)分子與溶劑分子或溶質(zhì)分子相互作用引起熒光強(qiáng)度降低的現(xiàn)象。 熒光熄滅劑：能夠引起熒光熄滅的物質(zhì)。3NH2NHNHOHOHHH 如： X離子、重金屬離子、氧分子以及硝基化合物、重氮化合物和羧基化合物。 五種形式: 熒光物質(zhì)的分子和熄滅劑分子發(fā)生碰撞而損失能量。 熒光物質(zhì)的分子與熄滅劑分子作用生成本身不發(fā)光的配位化合物。 熒光物質(zhì)分子中引入溴或碘后易發(fā)生體系間跨越而轉(zhuǎn)變

13、至三線(xiàn)態(tài)。 溶解氧的存在使熒光物質(zhì)氧化或由于氧分子的順磁性促進(jìn)了體系間跨越，使激發(fā)單線(xiàn)態(tài)的熒光分子轉(zhuǎn)變至三線(xiàn)態(tài)，從而引起熒光熄滅現(xiàn)象。 熒光自熄滅現(xiàn)象：當(dāng)熒光物質(zhì)濃度較高時(shí)，由于熒光分子間碰撞幾率增加而損失能量，使熒光熄滅。 熒光熄滅法： 利用一個(gè)熒光物質(zhì)在加入某種熄滅劑后，熒光強(qiáng)度的減小和熒光熄滅劑的濃度呈線(xiàn)性關(guān)系，可以測(cè)定熒光熄滅劑的含量。 6 散射光的干擾 散射光主要有瑞利光和拉曼光兩種：瑞利光：光子和物質(zhì)分子發(fā)生彈性碰撞時(shí)，不發(fā)生能量的交換，僅是光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變。其波長(zhǎng)與入射光波長(zhǎng)相同。拉曼光：光子和物質(zhì)分子發(fā)生非彈性碰撞時(shí), 光子運(yùn)動(dòng)方向發(fā)生改變，能量交換，發(fā)射光比入射光波長(zhǎng)稍長(zhǎng)

14、或稍短的光。 散射光對(duì)熒光測(cè)定有干擾，尤其是波長(zhǎng)比入射光波長(zhǎng)更長(zhǎng)的拉曼光，因其波長(zhǎng)與熒光波長(zhǎng)接近，對(duì)熒光測(cè)定的干擾更大。 硫酸奎寧在不同波長(zhǎng)激發(fā)下的熒光與散射光譜360350448硫酸奎寧激發(fā)nm35035040042/1 . 0350SOLHmolnm激發(fā)320448硫酸奎寧激發(fā)nm320a度強(qiáng)32036042/1 . 0320SOLHmolnm激發(fā)b度強(qiáng) 無(wú)論選擇320或350nm為激發(fā)光，熒光峰總在448nm，拉曼光波長(zhǎng)分別為360和400nm，其中，400nm的拉曼光對(duì)熒光的測(cè)定有干擾。 六 熒光分析儀器 用于測(cè)定熒光強(qiáng)度有濾光片熒光計(jì)、濾光片-單色器熒光計(jì)及熒光分光光度計(jì)三種類(lèi)型。

15、第一種類(lèi)型儀器不能測(cè)定光譜，可進(jìn)行定量分析； 第二種類(lèi)型儀器不能測(cè)定激發(fā)光譜，但可測(cè)定熒光光譜； 第三種類(lèi)型儀器既可測(cè)定激發(fā)光譜，又可測(cè)定熒光光譜。 1 熒光分光光度計(jì) 主要構(gòu)造：激發(fā)光源 單色器 樣品池 檢測(cè)器系統(tǒng)光源激發(fā)單色器樣品池質(zhì)物光吸面表發(fā)射單色器檢測(cè)器放大器指示器記錄器熒光分光光度計(jì)結(jié)構(gòu)示意圖 2 熒光分析儀器的校正 靈敏度校正 影響熒光分光光度計(jì)靈敏度的因素很多，與儀器的光源強(qiáng)度、單色器性能、光電管的靈敏度及放大系統(tǒng)的特征有關(guān)；與波長(zhǎng)、狹縫寬度有關(guān)；還與被測(cè)定的容器、溶劑等的雜散光有關(guān)。 因此，同一型號(hào)的儀器，甚至同一臺(tái)儀器在不同時(shí)間操作，所測(cè)得的結(jié)果也不盡相同。故使用前需進(jìn)行靈

16、敏度校正。 一般地，在每次測(cè)定時(shí)，在選定波長(zhǎng)及狹縫寬度的條件下，先用一種穩(wěn)定的熒光物質(zhì)配成濃度一定的標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行校正，將每次測(cè)得的熒光強(qiáng)度調(diào)節(jié)到相同數(shù)值（50%或100%）。 通常在紫外-可見(jiàn)光范圍內(nèi)用1ug/ml的硫酸奎寧標(biāo)準(zhǔn)溶液（0.05mol/L的硫酸中）進(jìn)行校正，因其產(chǎn)生的熒光十分穩(wěn)定。 波長(zhǎng)校正 若儀器的光學(xué)系統(tǒng)或檢測(cè)器有變動(dòng)，或在較長(zhǎng)使用時(shí)間之后，或在重要部件更換之后，可用汞燈的標(biāo)準(zhǔn)譜線(xiàn)對(duì)單色器波長(zhǎng)刻度重新校正。 激發(fā)光譜和熒光光譜的校正 測(cè)得的激發(fā)光譜和熒光光譜往往是表觀(guān)的，其原因較多，最主要原因是光源的強(qiáng)度隨波長(zhǎng)而變及每個(gè)檢測(cè)器對(duì)不同波長(zhǎng)的光的接受敏感程度不同，及檢測(cè)器的感應(yīng)與

17、波長(zhǎng)不呈線(xiàn)性。故應(yīng)用儀器上的校正裝置將每一波長(zhǎng)的光源強(qiáng)度調(diào)整一致。 七 定量分析方法 1 熒光強(qiáng)度和熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系 熒光強(qiáng)度正比于被熒光物質(zhì)吸收的光強(qiáng)度 即：F（ ） F= 代入上式后，展開(kāi)得：0IIF0IIK（ ）0IIElCIIBeer100定律：根據(jù) 由此可見(jiàn)：熒光強(qiáng)度與溶液中熒光物質(zhì)濃度呈線(xiàn)性關(guān)系。 熒光強(qiáng)度的靈敏度取決于檢測(cè)器的靈敏度，即只要改進(jìn)光電倍增管和放大系統(tǒng)，極微弱的熒光也能被檢測(cè)到，所以熒光分析法的靈敏度很高。KCElCIKFElCCElCElCElCIKF03203 . 205. 033 . 223 . 23 . 2時(shí)，上式可變?yōu)椋汉苄。?dāng)若濃度！）（！）（ 而紫外-

18、可見(jiàn)分光光度法依據(jù)的是吸光度與吸光物質(zhì)濃度的線(xiàn)性關(guān)系，所測(cè)定的是透射光強(qiáng)度和入射光強(qiáng)度的比值，即 ，因此，即使將光強(qiáng)信號(hào)放大，由于透射光強(qiáng)和入射光強(qiáng)都被放大，對(duì)提高檢測(cè)靈敏度不起作用。 故紫外-可見(jiàn)分光光度法的靈敏度不如熒 光分析法高。 2 定量分析方法 與紫外-可見(jiàn)光度法基本相同。0II 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法 即用已知量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)經(jīng)過(guò)和試樣相同的處理之后，配成一系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，測(cè)定這些溶液的熒光強(qiáng)度，以熒光強(qiáng)度為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，然后在相同條件下測(cè)定試樣溶液的熒光強(qiáng)度，由標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)求出熒光物質(zhì)的含量。 直接比較法 若標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)過(guò)原點(diǎn)，可采用此法。 在相同條件下測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的熒光強(qiáng)度，由熒光強(qiáng)度比及標(biāo)準(zhǔn)品的濃度可求出待測(cè)物質(zhì)的濃度。若空白溶液的熒光強(qiáng)度不為零，應(yīng)