1、一種新的老年癡呆動物模型組員： *摘要 建立一種新的老年癡呆 (AD) 小鼠模型 ,AD 及其治療藥物的研究。選用 NIH 小鼠 , 腹腔注射 D2 半乳糖 120mg/kg 和亞硝酸鈉 90mg/kg, 每天 1 次, 連續 60d, 制備老年癡呆動物模型。通過水迷宮試驗 , 腦組織勻漿蛋白質含量、乙酰膽堿酯酶 (AchE) 和超氧化物歧化酶 (SOD)活性的測定 , 腦組織病理切片 HE染色和剛果紅染色 , 比較老年癡呆模型小鼠和正常小鼠的差異。與對照組比 , 模型組小鼠的逃避潛伏期明顯增加 (P<0101), 腦內蛋白質含量沒有明顯差異 , 腦內 AchE活性增加 (P<01

2、01),SOD 活性下降 (P<0101); 模型組小鼠出現觸須脫落 , 大腦皮層出現類老年斑病理改變 , 海馬和大腦皮層神經元變性壞死。 D2半乳糖和亞硝酸鈉合并制備的老年癡呆模型在一定程度上模擬了AD的發病特點 , 可作為 AD及其治療藥物研究的一種新模型。關鍵詞 阿爾茨海默病 ; 學習記憶 ; 超氧化物歧化酶 ; 老年斑老年癡呆 (AD)缺乏有效治療手段的原因之一在于與人類AD 相似的動物模型未能真正建立起來 , 現有的 AD模型大多只針對 AD病理的某一方面 , 只能模擬 AD諸多病理變化中的一個側面 , 相對 AD 的多因素發病和錯綜復雜的病理過程來說均有較大的差距。因此 ,

3、建立能夠在行為以及組織病理方面較好地模擬AD 的動物模型是 AD研究的熱點之一 , 將有助于推動 AD發病機制的研究和治療藥物的篩選。已有許多文獻報道 , 小鼠、大鼠皮下注射或腹腔注射D2 半乳糖可造成亞急性衰老模型 , 注射亞硝酸鈉則可造成全身多臟器的缺血缺氧, 導致學習記憶成績下降 , 我們將二者結合起來 , 用 D2 半乳糖使青年小鼠在較短的時間內呈現出自然衰老小鼠的特征 ; 用亞硝酸鈉造成腦缺血缺氧 , 影響其學習記憶能力 ; 通過行為學試驗、腦內相關指標的測定、腦組織病理檢查等方法來研究這種模型與人類AD的相似程度 .1 材料和方法1.1 實驗動物和主要試劑 NIH 小鼠購自第一軍醫

4、大學實 驗動物中心 , 合格證號: 粵檢證字第 2000A037 號。蛋白定量 ( 雙縮脲法) 測定試劑盒( 批號20010801)、乙酰膽堿酯酶 (AchE) 活性測定試劑盒 ( 批號 20011105) 和超氧化物歧化酶 (SOD)活性測定試劑盒 ( 批號 20011109), 均購自南京建成生物工程研究所。 D2 半乳糖 ( 生化試劑 ) 上海試劑二廠產品 , 批號 991215。亞硝酸鈉 ( 分析純 ), 汕頭市光華化學廠產品 , 批號 20001020。1.2 小鼠 AD模型的建立 雌性 NIH 小鼠 40 只,20 24g, 每組 20 只 , 隨機分為空白對照組和 AD 模型組。

5、造模方法為 : 小鼠每日腹腔注射 D2 半乳糖 120mg/kg 和亞硝酸鈉 90mg/kg, 連續 60d; 空白對照組腹腔注射等體積生理鹽水。1.3 水迷宮試驗 自動記錄水迷宮裝置為 80cm×50cm×20cm 的茶色有機玻璃槽 ( 中國醫科院藥物所研制 ), 內設起點、終點 ( 臺階 ) 和多處盲端 , 水深 9cm,水溫24 27 , 記錄小鼠從起始點放入至找到臺階的時間( 尋找潛伏期 ), 若超過120s 則以 120s 計。給藥完畢后第1 天, 各組小鼠進行訓練 , 使其找到臺階 ; 第24 天加長路程 , 記錄各組小鼠的尋找潛伏期。1.4 腦內相關指標的測定

6、 行為學試驗結束后 , 每組取 10 只 小鼠禁食 12h, 斷頭處死 , 取全腦 ( 嗅腦除外 ), 置玻璃勻漿器 中, 加入預冷生理鹽水制成 10%(g/ml)腦勻漿 ,3000r / min 離心 10min, 取上清液置冰浴中 , 測定蛋白含量和活性 , 按試劑盒說明書所述步驟操作 , 取樣量均為 50 l 。AchE、 SOD1.5 病理檢查 各組余下小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉 60mg/ kg 麻醉 , 仰臥固定于手術臺上 , 剪開胸腔 , 暴露心臟 , 用生理鹽水和 4%多聚甲醛進行心臟灌注固定 , 至四肢僵直為止 , 取全腦和頰部皮膚組織置 4%多聚甲醛溶液中固定 24h, 石蠟包

7、埋切片 , 常規 HE染色和剛果紅染色。1.6 統計方法 數據以平均值±標準差表示 , 使用 SPSS810統計軟件處理 , 用 t 檢驗進行統計學分析。2 結 果2.1 水迷宮實驗結果 見表 1。可見模型組小鼠的尋找潛伏期始終明顯長于對照組 , 表明模型組小鼠的學習記憶能力下降。表 1 小鼠水迷宮逃避潛伏期測定結果 (s,x ±s)組別n第 2 天第 3 天第 4 天空白對照組1875.4±29.851.8±27.034.6± 12.6模型組17100.4±31.591.9±40.273.4± 27.1與空白對照

8、組比 :1)P<0105,2)P<0101;2.2 小鼠腦內生化指標測定結果 兩組間的蛋白質含量沒有 顯著差別 , 模型組AchE活性比空白對照組明顯升高 , 模型組 SOD活性比空白對照組明顯降低。表 2 小鼠腦內蛋白含量、 AchE活性、 SOD活性的 測定結果 (x ±s)組別蛋白含量 (mg/ml) AchE活性 ( mol/mg) SOD 活性 (nU/mg)空白對照組3.330.735± 0.05423.3±2.5模型組3.190.29±0.07615.9±1.42.3 病理檢查結果 腦組織切片顯示 , 對照組海馬和皮層

9、神 經細胞染色均一、結構完整 , 細胞膜、核膜清晰。模型組海馬可見明顯散在的或連續的神經細胞變性壞死 , 表現為胞漿深染、核固縮、胞膜核膜界限不清晰 ; 嚴重的出現點狀中斷 , 在大腦皮層也可見較多變性壞死的神經細胞 , 偶爾可見類老年斑結構 , 這些可能是其行為上出現障礙的病理基礎。實驗過程中 , 模型組小鼠在約 40d 時出現普遍的觸須脫落 。頰部皮膚組織切片顯示 , 對照組小鼠觸須的毛囊飽滿、圓整 , 內部結構層次豐富 , 被毛排列致密整齊 ; 而模型組的毛囊則出現萎縮、塌陷 , 由于觸須的脫落 , 毛囊內出現明顯的空洞 , 被毛排列稀疏、不規則。3 討 論D2 半乳糖造成動物的老化效應

10、早有報道, 青年小鼠長期注射D2 半乳糖后 , 由于其代謝產物半乳糖醇不能被進一步代謝而堆積在細胞內 , 影響滲透壓 , 導致細胞腫脹 , 代謝紊亂 , 體內活性氧水平升高 , 細胞膜脂質受損 , 以致產生機體多器官、多系統的功能衰退 , 這些變化均與老齡小鼠相似。 D2 半乳糖還會引起腦神經元的一系列退行性變化 , 包括神經元數目減少 , 腦組織中 SOD活性下降 ,MDA脂褐素水平升高 , 表現為學習記憶能力下降。因此我們給青年小鼠腹腔注射 D2 半乳糖 60d, 造成亞急性衰老模型來模擬 AD發生于老年人的特點。目前常采用 1 次腹腔注射亞硝酸鈉120mg/kg 造成小鼠的記憶鞏固障礙模

11、型, 亞硝酸鹽大量進入機體后 , 可使正常的血紅蛋白變為高鐵血紅蛋白 , 失去攜帶氧的功能 , 引起組織缺氧 , 導致大腦意識和行為上出現障礙。我們對此做了適當的改進 , 將劑量調整至死亡率較低的 90mg/kg, 并連續腹腔注射 60d, 通過較長時期的反復腦缺氧 , 造成動物學習記憶能力的 明顯下降。行為學試驗結果顯示 , 隨著訓練次數的增加、訓練時間的推移 , 空白對照組小鼠的尋找潛伏期迅速縮短 , 表明正常小鼠很快熟悉水迷宮環境并找到終點 , 而模型組小鼠的尋找潛伏期居高不下 , 表明模型組小鼠的學習記憶功能受損。Ach 是中樞膽堿能神經系統重要的神經遞質, 它由膽堿乙酰化轉移酶 (C

12、hAT)催化合成 , 乙酰膽堿酯酶 (AchE) 催化分解。迄今為止 , 多數研究表明AD患者腦內ChAT和 AchE 活性降低 ,Ach 含量不足 , 導致中樞神經系統功能障礙, 學習記憶能力下降。但有關 AD 動物模型腦內 AchE 活性變化的報道卻不盡一致, 有的降低 ,有的升高 , 主要是因為不同的作者采用的 AD 動物模型有很大差別 , 有的采用 D2 半乳糖和 AB 合并造模 , 有的僅用東莨菪堿一次腹腔注射造成動物學習記憶障礙。此外 ,AchE 活性測定方法的不同對結果可能也有一定影響。我們的研究結果顯示 ,AD 模型組小鼠腦內 AchE 活性增高 (P<0101) 。由于

13、 AchE 活性的異常增高 , 造成腦內神經遞質 Ach 被大量水解 , 含量下降 , 導致中樞神經系統功能障礙 , 出現學習記憶和認知能力下降。研究表明 ,AD 患者腦組織中總 SOD、 Mn2SOD和Cu/Zn2SOD活性均明顯低于正常腦組織 , 血清和腦脊液 SOD水平也比對照組低 , 而脂質過氧化物 (LPO) 水平則明顯升高 , 這提示 AD 的發生發展與自由基有密切的關系。體內過多的氧自由基能攻擊損害神經細胞膜 , 干擾細胞內酶系統的正常功能 , 造成神經細胞老化和變性 , 最終導致 AD發生。我們的實驗結果與上述報道相近 , 模型組小鼠腦內 SOD活性明顯降低 (P<010

14、1), 因此其清除氧自由基的能力下降 , 神經元受損 , 從而造成小鼠的認知功能減退。腦組織病理檢查顯示模型組小鼠大腦皮層和海馬均出現變性壞死的神經細胞, 皮層偶爾可見類老年斑結構 ,這與 AD 患者腦內出現的病理變化類似。由于中樞神經細胞一般是不可再生的 , 因此這種病理變化必然影響到腦內信息的傳遞和處理 , 從而使動物在行為、認知和學習記憶上出現障礙。此外 , 在實驗過程中出現了罕見的觸須脫落現象 , 觸須是小鼠特化的硬毛 , 是大腦的感覺器官 , 對于動物確定方位起著特別重要的作用。在結構上表現為毛囊周圍的神經與血管比一般的被毛豐富。因此 , 造模小鼠腹腔注射促使衰老的 D2 半乳糖和導

15、致缺血缺氧的亞硝酸鈉后出現觸須的缺失 , 這提示動物腦內可能出現了某些變化 , 這種效應是由 D2半乳糖引起的 , 還是由亞硝酸鈉引起的 , 或是二者共同作用造成的 , 其機制有待進一步探討。綜上所述 ,D2 半乳糖和亞硝酸鈉合并制備的 AD模型呈現了整體衰老、學習記憶能力減退、腦內 AchE 活性增加、 SOD活性下降、皮層和海馬神經元變性壞死、類老年斑形成等特性 , 在一定程度上模擬了 AD 的發病特點。鑒于 AD 發病的多因性 , 我們提出運用各種合理的干擾因素 , 從整體老化、中樞膽堿能神經系統受損、腦內 A和NFT形成等各個方面來最大程度地模擬人類 AD,現有的工作便是朝這一目標進行

16、的初步探索。4 參考文獻1 尹兆寶,王健,周如倩,等的影響 J 1 中國老年學雜志1 補腎方對老年性癡呆大鼠學習記憶和,2000;20(1):332341細胞因子2 張均田 1 現代藥理實驗方法 ( 上冊 ) M 1 北京 : 北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社 ,1998:10292103113 龔國清, 徐黻本 1 小鼠衰老模型的研究J 1 中國藥科大學學報 ,1991;22(2):101210314 秦海強 , 李 亞, 田蘇平 12 淀粉樣蛋白及 D2 半乳糖對大鼠學習記 憶和膽堿酯酶活性的影響 J 1 南京醫科大學學報 ,2000;20(3):195219715 田金洲 , 楊承

17、芝 , 楊惠民 1 復方大黃制劑對老齡小鼠大腦皮質和海馬 ChAT、AchE活性及 Ach 含量的影響 J 1 中國老年學雜志 ,1999;19(1):3223316 趙偉, 徐宏平1 老年性癡呆患者血清和腦脊液SOD及 LPO含量 測定 J 1 河南醫科大學學報 ,1998;33(2):632641 出師表兩漢：諸葛亮先帝創業未半而中道崩殂，今天下三分，益州疲弊，此誠危急存亡之秋也。然侍衛之臣不懈于內，忠志之士忘身于外者，蓋追先帝之殊遇，欲報之于陛下也。誠宜開張圣聽，以光先帝遺德，恢弘志士之氣，不宜妄自菲薄，引喻失義，以塞忠諫之路也。宮中府中，俱為一體；陟罰臧否，不宜異同。若有作奸犯科及為忠

18、善者，宜付有司論其刑賞，以昭陛下平明之理；不宜偏私，使內外異法也。侍中、侍郎郭攸之、費祎、董允等，此皆良實，志慮忠純，是以先帝簡拔以遺陛下：愚以為宮中之事，事無大小，悉以咨之，然后施行，必能裨補闕漏，有所廣益。將軍向寵，性行淑均，曉暢軍事，試用于昔日，先帝稱之曰 “能 ”，是以眾議舉寵為督：愚以為營中之事，悉以咨之，必能使行陣和睦，優劣得所。親賢臣，遠小人，此先漢所以興隆也；親小人，遠賢臣，此后漢所以傾頹也。先帝在時，每與臣論此事，未嘗不嘆息痛恨于桓、靈也。侍中、尚書、長史、參軍，此悉貞良死節之臣，愿陛下親之、信之，則漢室之隆，可計日而待也。臣本布衣，躬耕于南陽，茍全性命于亂世，不求聞達于諸侯。先帝不以臣卑鄙，猥自枉屈，三顧臣于草廬之中