1、重慶永川區(qū)衛(wèi)星湖水庫(kù)水體細(xì)菌多樣性調(diào)查（第二小組 廖敏鵬 劉興 魏淑婷）1.衛(wèi)星湖水庫(kù)自然環(huán)境情況的介紹重慶市永川區(qū)屬于亞熱帶季風(fēng)性濕潤(rùn)氣候，平均氣溫18.2 ，最高氣溫39 ，最低氣溫2 。年平均降雨量1042.2 mm，平均日照1298.5 h，年平均無(wú)霜期317 d。衛(wèi)星湖全長(zhǎng)8公里，水面1500畝，最大水深15 m，庫(kù)容999×104m3湖灣交錯(cuò)，有自然形成的多個(gè)半島和全島。湖西北岸為全國(guó)農(nóng)業(yè)旅游示范區(qū)、省級(jí)森林公園黃瓜山和著名的比子溝風(fēng)景區(qū)，湖東南岸為金三維生態(tài)花卉園區(qū)。在2000年衛(wèi)星湖永川區(qū)政府列為永川市民的飲用水源之一，因此明確衛(wèi)星湖水庫(kù)中細(xì)菌的多樣性就顯得尤為重要。

2、2.材料2.1 實(shí)驗(yàn)試劑提取緩沖液：200mM NaPO4, 120mM異硫氰酸胍，2%PVP-k30.150mM氯化鈉, 2%SDS, 0.5MTris腐植酸去除劑：100mM 十二水硫酸鋁銨DNA結(jié)合液：4.5M 異硫氰酸胍 ，0.5M 醋酸鉀 (pH 5.2)，溴酚紅少許膜洗滌液：50 mM Tris-cl，0.1mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脫液：2.5mM Tris-HCl(pH8.5)或超純水（無(wú)DNA酶）  pH8.0 5×TBE（5倍體積的TBE貯存液）配1000ml 5×TBE：Tri

3、s 54g硼酸 27.5g0.5mol/l EDTA 20ml（pH 8.0）凝膠加樣緩沖液（6×）溴酚藍(lán) 0.25%蔗糖 40% 瓊脂糖 溴化乙錠溶液（EB） 0.5g/ml Taq DNA聚合酶，10×PCR buffer,25mmol/lMgcl2,0.225mmol/ldNTP, 10umol/l引物，模板DNA分子（0.1-2ug/ul）DNA結(jié)合液：6M NaClO4 (pH 5.2) ，0.03M NaAC (pH 5.2) 溴酚紅少許膜洗滌液：50 mM Tris-cl，0.1 mM EDTA，pH 8.0 70-80% 乙醇 洗脫液：2.5mM Tris-

4、HCl(pH8.5)或超純水（無(wú)DNA酶）  pH8.0 尿素、去離子甲酰胺、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、瓊脂糖PCR擴(kuò)增相關(guān)試劑2.2 實(shí)驗(yàn)器材5ml離心管，1.5ml離心管，槍頭，硅膠膜純化柱。1.6um、0.22um 濾膜，真空抽濾裝置。瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng) ，凝膠成像系統(tǒng)或紫外投射儀，PCR擴(kuò)增儀，PCR用薄壁管，移液槍及電泳儀，高速臺(tái)式離心機(jī) 、微量取液器；1.5，0.5和0.2ul的EP管、水浴鍋，電子秤、切下的含有回收片段的瓊脂糖凝膠P,變性梯度凝膠電泳儀,凝膠成像及分析系,高速離心機(jī),電泳槽。實(shí)驗(yàn)步驟3.1基因組總DNA的提取3.1.1水體樣品采集根據(jù)河流湖泊采樣規(guī)則，實(shí)

5、地勘察衛(wèi)星湖周邊的環(huán)境設(shè)施，在衛(wèi)星湖周邊區(qū)域設(shè)定了10個(gè)采樣點(diǎn)（具體采樣點(diǎn)的分布見圖1，學(xué)校一側(cè)5個(gè)，對(duì)岸5個(gè)），每個(gè)水樣采集1升，記錄采樣地環(huán)境參數(shù)（位置GPS經(jīng)緯度，溫度，周圍環(huán)境描述）。水體樣品采用1.6um孔徑的濾膜真空濾除懸浮物和真核微生物，再利用0.22um孔徑的聚碳酸酯膜收集微生物細(xì)胞。 取下過(guò)濾裝置漏斗部分，使用兩只滅菌鑷子從邊緣夾起濾膜，濾膜上面朝內(nèi)卷成圓筒狀。放入5ml離心管中-20保存?zhèn)溆谩D一. 取樣位置圖3.1.2微生物基因組DNA提取.在5ml樣品管中加入1 ml提取緩沖液。 注意：提取緩沖液使用前必須先預(yù)熱溶解沉淀并趁熱使用。若樣品中含有難裂解微生物，可額外56水

6、浴10min。【去垢劑可破壞細(xì)胞壁，去除非DNA的有機(jī)、無(wú)機(jī)成分】.把5ml離心管放入渦旋研磨儀適配器中，最大轉(zhuǎn)速渦旋振蕩5min。 【渦旋振蕩的機(jī)械作用力在打碎濾膜表面沉積物釋放出截留細(xì)胞的同時(shí)輔助裂解細(xì)胞】.室溫4000g離心2 min。 .使用1ml槍頭深入到底部吸取上清，并轉(zhuǎn)移600ul上清到一個(gè)干凈的1.5ml 離心管中。.加入0.4倍體積的乙酸銨，混勻，冰上放置10min。【移除腐植酸、細(xì)胞碎片、蛋白等非DNA 的有機(jī)、無(wú)機(jī)成分】 13000g離心1min。 避開沉淀轉(zhuǎn)移上清到一個(gè)干凈的2ml管中。 .加入等體積的DNA結(jié)合液，混勻。 【DNA 在高鹽條件下將選擇性地吸附到離心柱硅

7、膠濾膜上 】.加載650l上清到一個(gè)離心柱硅膠濾膜中，13000g離心1min。棄去濾液重復(fù)上述步驟直到過(guò)濾完所有上清。 注意：通常需要加樣兩次。 .加入650l膜洗滌液到濾膜中，13000g離心1min。 去掉濾液。重復(fù)1次。【膜洗滌液為含酒精沖洗液，用于沖洗離心柱濾膜，去除殘留的鹽分等雜質(zhì)】.把離心柱硅膠濾膜放到一個(gè)干凈的1.5ml 離心管中。 .加入100l洗脫液到離心柱白色濾膜中心。 【DNA在無(wú)鹽條件下選擇性地洗脫下來(lái)】 .13000g離心1min。 .棄去離心柱。DNA（-20-80）保存。3.2.DNA的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)3.2.1制備瓊脂糖凝膠.按照被分離DNA的大小，決定凝膠

8、中瓊脂糖的百分含量。可參照下表：瓊脂糖凝膠濃度/% 線性DNA的有效分離范圍/kb0.3 5600.6 1200.70.8100.90.571.20.461.50.242.00.13.稱取0.24g瓊脂糖，放入錐形瓶中，加入80ml 0.5×TBE緩沖液，置微波爐或水浴加熱至完全溶化，取出搖勻，則為0.8%瓊脂糖凝膠液，加入1.5l的EB。3.2.2.膠板的制備.取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈，晾干。.將有機(jī)玻璃內(nèi)槽放置于一水平位置，并放好樣品梳子。.將冷到60左右的瓊脂糖凝膠液，緩緩倒入有機(jī)玻璃內(nèi)槽，直至有機(jī)玻璃板上形成一層均勻的膠面（注意不要形成氣泡）。 .待膠凝固后，取出梳子，取下橡皮膏

9、，放在電泳槽內(nèi)。.加入電泳緩沖液至電泳槽中。3.2.3.加樣用移液槍將已加入上樣緩沖液的DNA樣品（上次實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒DNA和基因組DNA）加入加樣孔中（記錄點(diǎn)樣順序及點(diǎn)樣量）。 3.2.4.電泳.接通電泳槽與電泳儀的電源（注意正負(fù)極，DNA片段從負(fù)極向正極移動(dòng)）。DNA的.遷移速度與電壓成正比，最高電壓不超過(guò)5V/cm。.當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動(dòng)到距凝膠前沿12cm處，停止電泳。.凝膠圖像分析系統(tǒng)拍照觀察3.3.聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù).在50 ul反應(yīng)體系中分別加入：MiniQ H2O37.5ul10×PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1

10、ul引物1(10M) 1ul引物2(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（cDNA） 1ul終體積為50 ul （此處我忘記了總體積和各個(gè)配樣的體積，你們改一下）注意：如果只是普通的檢測(cè)，而無(wú)須回收時(shí)，則25ul的反應(yīng)體系即可（上述體系中的各成分相應(yīng)減半）.短暫離心混勻后，放入PCR儀中，反應(yīng)程序如下：I） 943-5minII） 94 1min581min 721min30sec 30-35個(gè)循環(huán) III） 72 7-10minIV） 4 保存.反應(yīng)完成后，將PCR產(chǎn)物用1瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，并拍照記錄實(shí)驗(yàn)結(jié)果.將目的條帶（16s核糖體DNA片段）從瓊

11、脂糖凝膠上切下，放入1.5ml離心管中，稱取重量后于-20保存。3.4. DNA的瓊脂糖凝膠回收 .按照標(biāo)準(zhǔn)的方法進(jìn)行DNA電泳，請(qǐng)使用質(zhì)量好的高熔點(diǎn)瓊脂糖，或低熔點(diǎn)瓊脂糖，使用TAE或TBE為電泳緩沖液。. 取與樣本數(shù)相同的若干1.5ml離心管，分別稱量后記錄下重量。. 使用插入染料如溴化乙錠對(duì)DNA進(jìn)行染色。在較長(zhǎng)波長(zhǎng)紫外燈下，用干凈的手術(shù)刀片或刮胡刀片切下含有目的DNA的瓊脂糖凝膠塊，盡量減小膠塊的體積。為防止DNA 損傷，要盡量縮短DNA暴露在紫外燈下的時(shí)間。將膠切片轉(zhuǎn)入已稱重的離心管中，再稱重后減去空管的重量，得到膠切片的重量。注意：膠切片可在4或-20于無(wú)RNA 酶的離心管中儲(chǔ)存一

12、周，請(qǐng)務(wù)必蓋緊管蓋。.按照每10mg膠切片加10ul結(jié)合液的比率加足量膜結(jié)合液。.振蕩混合以上混合物，在50-65下孵育10分鐘，或直到膠塊完全融解。每隔幾分鐘振蕩離心管以加速膠塊的融解。室溫短暫離心，使溶液集中于管底。【溶液顏色應(yīng)為黃色(pH<7)，如為紅色(pH>8)，加入10ul 3M 醋酸鈉（pH5.0)調(diào)節(jié)為黃色】.將溶液加入硅膠模離心柱中，室溫放置5ml。.14000g離心2分鐘。 .加入700ul洗滌液，室溫放置5min,14000g離心2分鐘。.重復(fù)步驟6一次。.室溫干燥2分鐘，加入50ul預(yù)熱的洗脫液，室溫放置5min,14000g離心2分鐘。棄硅膠膜離心柱。.檢

13、測(cè)回收DNA的吸光度，計(jì)算其含量和純度3.5.DGGE檢測(cè)微生物多樣性3.5.1.DGGE分析樣品的制備PCR反應(yīng)（同前）1）在50 ul反應(yīng)體系中分別加入：MiniQ H2O28.5ul10×PCR buffer 5ul25mM MgCl2 3ul10mM dNTP mix 1ul引物1(10M) 1ul引物2(10M) 1ulTaq(2 to 5 units/ul) 0.5ul模板（回收DNA） 10ul終體積為50 ul 其中，引物為357F-GC和518R，退火溫度為55，延伸時(shí)間30s，循環(huán)數(shù)34。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)。點(diǎn)樣1ul，片段大小為200bp。3.5.2.垂直變性梯度凝膠電泳分析變性梯度凝膠電泳變性梯度遞增的方向與電泳方向平行。所使用的膠為9%聚丙烯酰胺凝膠，變性濃度為36%-54%。其中，含7 M尿素和40%去離子甲酰胺的膠為100%變性，不含尿素和去離子甲酰胺的膠為0%變性。PCR產(chǎn)物加上樣緩沖液后，