1、.一、提取組織 RNA1準(zhǔn)備好冰盒、 1.5mlEP管(無(wú)RNA 酶 )、剪刀及鑷子（需消毒，再用滅菌純水和 DEPC 水洗凈）、鉆頭、滅菌純水等。2. 取出凍存管，剪取約 0.5cm放于 EP管。3. 即刻加 1ml trizol ，剪碎至無(wú)可見微粒，靜置5-10min4. 加0.2ml 氯仿，蓋緊 EP管，上下傾倒，混勻 15s, 15-30靜置 2-3min5. 離心 12,000g*15min, 2-8 6. EP管內(nèi)分三層，取上層液相置于新 EP管7. 加0.5ml異丙醇，上下顛倒混勻， 15-30靜置 10min8. 離心 12,000g*10mim, 2-8 9. 棄上清（不用吸

2、凈殘液），加 1ml 75% 乙醇清洗沉淀 (乙醇用前需 4預(yù)冷 )10. 離心 10000/7500g*5min, 2-8 11. 去上清（需吸凈殘液），干燥 RNA( 超凈臺(tái)內(nèi)風(fēng)干至白色變透明狀， 約1h以上 ), 加10 12ul DEPC水解（約 1h以上），測(cè)濃度， -80保存。PS：1.所用槍頭、 EP管、 DEPC水、純水、剪刀、鑷子均需滅菌。2.75%無(wú)水乙醇用前需 4預(yù)冷。3若最后提取出的 RNA 量多，可加 30ulDEPC水溶解 ;若難以溶解，可置于 55水浴加熱。4破碎：取組織勿過(guò)多，否則難以破碎，亦難以提取 RNA ；一個(gè)樣品破碎過(guò)后需清洗，順序?yàn)椋壕凭耷虿料?DE

3、PC水洗 拆分清理 純水洗 棉球吸去鉆頭殘液。5. 破碎儀的使用：打開前先保證已調(diào)于低檔，將鉆頭浸沒(méi)于樣品中，切忌在空氣中空轉(zhuǎn)，從低到高慢調(diào)，同時(shí)上下輕移樣品，注意力度控制，避免液體飛濺誤傷；同時(shí)注意聽破碎時(shí)的聲音，若有尖銳聲音發(fā)出，說(shuō)明有異物卡住鉆頭，需停止查看。二、提取細(xì)胞 RNA1. 細(xì)胞加 1ml trizol 裂解 5min, 15-302. 加0.2ml 氯仿，蓋緊 EP管，上下傾倒，混勻 15s, 15-30靜置 2-3min其余步驟參見提取組織 RNA 的第 5步開始PS：1. 新EP管需用無(wú) RNA 酶 EP管。2. 操作過(guò)程需時(shí)刻注意避免污染， EP管取放時(shí)勿碰到內(nèi)壁及管口

4、， 每步操作前需適時(shí)擦拭雙手及槍管。3RNA 勿照紫外。4DEPC水量較關(guān)鍵，需保證RNA 充分均勻融解，若可用肉眼看到白點(diǎn)，可多加至20ul。三、測(cè) RNA 濃度：準(zhǔn)備 96孔板 開蓋，蓋子朝天放 加98ulEDPC 預(yù)讀（ setting：OD值 260；選中區(qū)域；選“預(yù)讀 ”） “ Read” 結(jié)果復(fù)制 拿出孔板， 再加 2ulRNA 直接 “READ”;. 復(fù)制結(jié)果（復(fù)制后的結(jié)果與軟件上的不同，此為已經(jīng)相減后的數(shù)據(jù)） 重設(shè)條件（ setting：OD值 260 280；選中區(qū)域； “Normal；” “Delete；”“OK”） “ READ” 復(fù)制結(jié)果 數(shù)據(jù)處理：CRNA (ug/m

5、l)=“ Normal值” 預(yù)讀值CRNA (ug/ul)=50( 稀釋倍數(shù) )*40 （ OD值） *1/1000* C RNA (ug/ml)=2* C RNA (ug/ml)VRNA =1ug（可變） / CRNAVH2O =V （總體積由說(shuō)明書得）V RNAPS：1.C260/ C280的比值意義范圍為 1.8 2.0,小于 1.8可能是蛋白含量較多，大于 2.0可能是 DNA 含量較多2往孔板加液時(shí)，勿使槍頭頂端碰觸孔板內(nèi)壁，以防損傷內(nèi)壁包被液3. 樣品多的話，不用分別加入，可先配總量，再分裝四反轉(zhuǎn)錄 PCR1加： 1uloligo(dT)1ng5ug總RNA1ul10mMdNTP

6、混合物滅菌水（ DEPC）加至 11ul（ 12-1）2混合物：放入 PCR儀 65，5min結(jié)束后迅速移至冰上3加： 4ul5*buffer2ul0.1M DTT輕混勻 PCR37 ， 2min4. 室溫下加入 1ul M- MLV 輕混勻（防氣泡）5PCR儀： 37， 50min + 70,15min + 4 , 5minPS:1.冰上操作，嚴(yán)格遵守?zé)oRNA 酶操作2加液時(shí)，槍頭貼近液面快速打出液體，提離液面后放松五 Q-PCR1.加液： SYBR5ul（ ROX0.2ul（ eppendorf AG PCR無(wú)需加此物）Primer0.2 0.2ulcDNA0.5ulH 2O4.1ul2.

7、離心：A、8聯(lián)管：樣品對(duì)稱離心 打開離心機(jī)總開關(guān) 打開蓋子 對(duì)稱放入樣品 蓋面上的白點(diǎn)對(duì)準(zhǔn)機(jī)孔邊的標(biāo)簽蓋好 按“啟動(dòng) ” 轉(zhuǎn)速升到 “1100左”右 按“停止 ” 等轉(zhuǎn)速降至 “60左”右開蓋取出 儀器復(fù)位B、96孔板：水平離心， 3000rpm,3-5minPS：加液或轉(zhuǎn)運(yùn)樣品時(shí)均需用到冰盒。3. 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR的使用（ eppendorf AG PCR）：A儀器結(jié)構(gòu)：上部為熒光檢測(cè)儀，下部為熱循環(huán)儀；銀質(zhì)模塊，光源為L(zhǎng)ED ；;.2個(gè)光電倍增管（ CPM檢測(cè)器）；4通道檢測(cè)： 520nm,550nm,580nm,608nm； B. 備注：運(yùn)行前需預(yù)熱 15min,PCR儀可過(guò)夜運(yùn)行。

8、此儀器需 3個(gè)月校正一次，用 DDwater（去離子水） 20ul，默認(rèn)校正溫度為60。默認(rèn)熱啟動(dòng)，每分鐘升溫8，可 1次自檢 /15min。關(guān)于指示燈： 閃爍表明在運(yùn)行； 亮綠燈表明在保溫； 亮桔燈表明在自檢。軟件登錄密碼為E/e；連續(xù)開啟軟件，間隔時(shí)間為1-2s；此儀器無(wú)需用ROX 作為校正熒光。此程序可根據(jù)已完成循環(huán)的熒光信號(hào)（原始數(shù)據(jù)） 進(jìn)行數(shù)據(jù)分析， 在反應(yīng)結(jié)束前即可觀察結(jié)果。設(shè)置條件時(shí)一般選擇相對(duì)定量，即藍(lán)色桶狀圖標(biāo)； 紅色桶狀圖標(biāo)為絕對(duì)定量。C軟件操作：開啟電腦 開 PCR儀 雙擊軟件圖標(biāo) 口令 “E/e” 點(diǎn)擊軟件界面上端菜單左 2 進(jìn)入操作界面 建立用戶： 點(diǎn)擊上左 6，選第

9、一個(gè)，點(diǎn)擊進(jìn)入設(shè)置 （選擇管理員用戶） 等待指示燈由黃變綠進(jìn)入界面 “ plate layout進(jìn)行設(shè)”置， “ Filter 520nm” :“；SYBR”“ Sample Vol 上”:樣體積； “ background ” : “ Axygen-strips8 ”管(80)放入樣品（記住安放順序，蓋緊蓋子且勿污染蓋面，輕放樣品以防產(chǎn)生氣泡或產(chǎn)生內(nèi)壁殘液） 點(diǎn)住鼠標(biāo)左鍵，選定樣品區(qū)域，點(diǎn)擊右鍵，選擇 “unkown”（相對(duì)定量），標(biāo)記引物名稱 選定內(nèi)參區(qū)域，點(diǎn)擊右鍵，選擇“ Standard（相”對(duì)定量），標(biāo)記內(nèi)參名稱轉(zhuǎn)換界面進(jìn)入 “PCR Program”，設(shè)置反應(yīng)體系（鼠標(biāo)移至目標(biāo)區(qū)域，點(diǎn)擊右鍵，選“Insert ”,插入所需項(xiàng)）；選中下方的“TSP Heated Lid及”“Impulse；”“Temp.Mode”：“ standard 設(shè)”置完后需保存，在點(diǎn)擊 “運(yùn)行 ” 反應(yīng)體系：952min9415s40*(熒)6025s溶解曲線 (點(diǎn)擊鼠標(biāo)右鍵 “ Insert ” “l(fā)tingMe”)：95 /