1、整理課件免疫膠體金技術簡介Immune colloidal gold technique2015-1-27整理課件目錄1膠體金技術的種類2 膠體金的合成3膠體金的標記與純化4 膠體金免疫層析法試劑的組成5膠體金免疫層析試紙的應用7膠體金技術的發展膠體金免疫層析試紙的檢測模式6整理課件l 膠體金免疫層析（Gold Immune Chromatographic Assay, GICA）技術是結合了膠體金技術和免疫層析技術發展而來的，其本質為一種固相反應的 ELISA,并用膠體金來代替底物顯色。l 免疫膠體金技術 是以膠體金作為示蹤標志物應用于抗原抗體的一種新型的免疫標記技術。l 膠體金標記 實質上

2、是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。整理課件膠體金技術的發展 1939-雛形 Kausche等把煙草花葉病毒吸附到金顆粒上在電子顯微鏡下觀察金離子呈高電子密度。 1971-作為標記物應用于免疫組織化學研究 Faulk等首先將兔抗沙門菌抗血清與膠體金顆粒結合，用直接免疫細胞化學技術檢測沙門菌的表面抗原。 1974-實現間接免疫金染色法 Romano將膠體金標記到馬抗人的IgG上，實現了間接免疫金染色法整理課件膠體金技術的種類及優點l 快速免疫金滲濾法快速免疫金滲濾法(immuogold filtration assay ,IGFA) 即穿流式(flow through)的固相膜免疫

3、測定。 主要由兩部分組成：膜滲濾裝置和標記結合物。前者為一塑料小盒，其中填滿吸水性物質，面上緊貼放置一片吸附有抗體(以雙抗體夾心法測抗原為例)的硝酸纖維膜，標記結合物為免疫金。整理課件 l 免疫層析法免疫層析法( immunochromatogra-phy，ICA) 是繼IGFA之后發展起來的另一種固相膜免疫測定，與IGFA利用微局限性膜的過濾性能不同，免疫層析法中滴加在膜一端的樣品溶液受膜的毛細管作用(基于層析作用的橫流 （lateral flow） )向另一端移動。移動過程中被分析物與固定在膜上某一區域的受體(抗原或者抗體)結合而被固相化，無關物質則越過該區域而被分離，然后通過標記物顯色來

4、判定試驗結果，以膠體金為標記物的實驗稱為膠體金免疫層析試驗。整理課件免疫膠體金技術的特點優點： 檢測方法簡單而快速，數分鐘即可得出結果； 不需儀器設備，操作人員不需特殊訓練； 試劑穩定，適用于單份測定； 無污染； GICA的特點是單一試劑，一步操作。小型實驗室即有條件開發生產。 干燥包裝的試劑可在室溫保存一年以上。 整理課件 最近由于原料的精選和制作工藝的改進，已能制備出可用于定量測定的GICA試劑。Roche公司生產的用于急性心肌梗死診斷的肌鈣蛋白和肌紅蛋白的GICA試劑和匹配的簡便測讀器Cardiac Reader，其精密度和準確性均符合定量測定要求。 不足： 金免疫測定中應用的是單份試劑

5、，難于進行質量控制。即使是同一批生產的試劑，也很難保證每個試劑的同一性。因此金免疫測定一般只能用于定性試驗。其定量檢測和靈敏度的提高還有賴于新原料和新材料的開發與應用。整理課件膠體金的合成 白磷還原法(1905年)可合成3nm左右大小的金顆粒； 白磷還原法(1925年)經改良后，可合成512nm大小的金顆粒； 抗壞血酸還原法(1958年)可合成613nm大小的金顆粒； 檸檬酸三鈉還原法(1973年)可合成5nm、15nm、30nm、60nm大小的金顆粒； 乙醇超聲波還原法(1980年)可合成610nm大小的金顆粒； 硼氫化鈉還原法(1982年)可合成317nm大小的金顆粒； 單寧酸檸檬酸三鈉還

6、原法(1985年)可合成317nm大小的金顆粒。 整理課件膠體金合成 將100ml的0.1H2AuCl4加入200ml的錐形瓶中，并將其置于攪拌電熱爐上，加入一個磁力條并將溶液加熱至沸騰。 向沸騰的溶液中加入1.5ml的0.1二合水檸檬酸三鈉，Na3C6H5O7.2H2O 當獲得深紅顏色的溶液時停止加熱制備膠體金試紙條常用的一般是檸檬酸三鈉還原法整理課件膠體金膠體金粒徑粒徑（nm）1檸檬酸檸檬酸三鈉加入量三鈉加入量（ml）*呈色呈色max162.00橙色橙色518nm24.51.50橙紅橙紅522nm411.00紅色紅色525nm71.50.70紫色紫色535nm膠體金的合成整理課件l注意事項

7、注意事項（1）氯金酸易潮解，應干燥、避光保存。（2）氯金酸對金屬有強烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時，不應使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質量的去離子水。（4）是以制備膠體金的玻璃容器必須是絕對清潔的，用前應先經酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經硅化處理的，硅化方法可用5二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。 整理課件膠體金的質量鑒定優質金顆粒和劣質金顆粒 劣質金外形不均一，且非球形，有凝集現象，顆粒間變異系數較大 。透射電鏡下觀察其顆粒大小及均勻度理想的金顆粒大小基本相等，均勻一致，無橢圓形及多角形的金顆粒存在。 整理課件雙

8、電層結構保證了膠體金的穩定性，使金顆粒始終以懸浮狀態存在。膠體金溶液通常由呈單一分散狀態的金顆粒組成，金顆粒直徑在 1-100nm 之間，而穩定的金溶液則要求金顆粒維持在某一固定直徑不變。蛋白通常帶有多種電荷，當蛋白帶正電時，能與膠體金所帶的負電荷相互作用；而蛋白中的疏水氨基酸能通過疏水作用將蛋白結合至金顆粒表面；有些蛋白則可通過半胱氨酸的巰基與金顆粒共軛連接。膠體金的蛋白標記整理課件金標樣本程序l將膠體金調整至正確的pH值l確定最小蛋白含量l最終結合（標記）l純化整理課件膠體金調整正確的pH值 膠體金與蛋白質的結合成功與否，取決于pH值，一般只有在蛋白質等電點(PI)略偏堿的條件下二者才能牢

9、固地結合，因此，標記之前須將膠體金溶液的pH值調至待標記蛋白質的等電點略偏堿。 需要提高膠體金的pH值時可用0.1molK2CO3，需要降低膠體金的pH值時可用0.1N HCl。測定金溶液的pH可能損害pH測定計的探頭，因此，一般用精密的pH試紙測定其pH即可.整理課件常見蛋白標記條件整理課件最小蛋白用量的確定l （1）光電比色法：制備一系列不同濃度的等體積蛋白質溶液（1ml），分別加入5ml膠體金中，迅速混勻，然后，各加入1ml 10% NaCl溶液，搖勻，靜置5min后測各管。根據膠體金顆粒的大小，OD在520580nm之間測定，以OD值為縱坐標，蛋白質用量為橫坐標作一曲線，取曲線最先與橫

10、軸相接近的那一點處的蛋白質用量為最適穩定量。圖中10nm的膠體金溶液中蛋白質的最適穩定量為45g/ml。整理課件l （2）目測法：以目測法確定膠體金與待標記蛋白質用量比例，將標記的蛋白質逐級稀釋后（由5g45g另設對照管），各取等體積順序加入一系列裝有1ml膠體金的試管中，5min后，在上述各管內分別加入0.1ml 10%氯化鈉，依表順序進行。整理課件發現 1、2 號管出現黑色沉淀且紅色全部褪去，3 號管雖然能保持紅色，但是管底也出現了一定量的黑色沉淀，而 4、5 號管顏色無變化與對照顏色一致，最低蛋白量即為4號管的蛋白量。整理課件最終結合（McAb） 取100ml金溶液，調整pH值至8.2

11、調整濾過和離心的抗體溶液（0.1g/l）至pH8.2 當金溶液在快速攪拌時要逐滴加入定量的抗體（蛋白最小濃度量加10%即蛋白穩定量），大約5分鐘加完 在金標溶液中加入10ml濾過的10BSA至終濃度為1%，并輕輕攪拌10分鐘。整理課件純化l 超速離心法、凝膠過濾法膠體金顆粒/nmpH標記蛋白質離心力/g時件/min59.0羊抗人IgG4500045108.2McAb4500030156.5鏈霉親和素12000045206.0SPA12000030109.0羊抗兔IgG12000060幾種免疫金探針離心純化條件整理課件膠體金免疫層析法試劑的組成整理課件u樣品墊(Sample pad)： 玻璃纖維

12、、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規格，批間穩定。 樣品墊的作用： 減緩樣品滲透速度，有利于樣品在結合墊上均勻分布； 去除樣品中雜質顆粒； 調節樣品液pH值或粘度等。樣品墊可使用化學物質進行浸漬處理，從而減少樣本差異，提高試驗的靈敏度。通?？梢詫⑾礈靹?、粘性增強劑、阻滯劑及鹽滲入樣本墊然后加以干燥，該工藝可避免使用復雜辨識劑/追跡緩沖液的麻煩，使檢測一步完成。整理課件u結合墊(Conjugate pad)： 玻璃纖維、聚酯膜、纖維素濾紙、無紡布等多種材質，多種規格，批間穩定。結合墊的作用主要為： -吸附一定量的金標結合物顆粒；-吸附并持續不斷的將樣品轉移到NC膜上；-保持金標結合物顆

13、粒的穩定性；-保證金標結合物顆粒定量完全釋放等。 玻璃纖維膜玻璃纖維膜/聚酯纖維膜聚酯纖維膜整理課件u硝酸纖維素膜( Nitrocellulose)： 一般使用Millipore，MDI，S&S，whatman 等國外公司的硝酸纖維素膜。 NC膜的作用： - 在檢測線和對照線條帶區域固定抗體；-樣品在NC膜上流動并與試劑混合發生免疫反應；-反應在NC膜上顯色，讀檢測結果 NC膜的重要參數： 孔徑、對稱性、層析速度、表面活性劑、蛋白結合力、強度、表面質量、厚度、批間均一性等。整理課件硝酸纖維膜的選擇u膜的分類標準膜的分類標準(m和和s) m: 指的是膜孔徑 換算情況大致為：8m=135s

14、；6m=180s u不同秒數的膜對反應的影響不同秒數的膜對反應的影響 通過速度越快和包被在T線的物質反應時間也就越短，讀數快，那么靈敏度也就越低。反之，反應時間長，讀數慢，也就靈敏度高。同時還有一個問題是，反應時間越長，發生非特異性結合的可能性就越大，所以過長時間的反應不一定就能夠真正的提升靈敏度。 135s一般用在雙抗體夾心法，一般用在雙抗體夾心法，180s一般用在競爭法一般用在競爭法. 整理課件u片材： 不干膠塑料襯底，片材的質量很大程度上影響了產品的貨架期。u吸收墊(Absorbent Pad)： 提供高吸收率、高容量以及相對穩定吸收率的吸收紙； 吸收紙的作用： 主要表現在控制樣品的流速

15、，促進虹吸作用以及使試劑跨過膜而不僅僅移到膜上。整理課件膠體金免疫層析試紙模式 雙抗體夾心模式 疫病抗原檢測 競爭模式 小分子物質檢測 SPA/蛋白G模式 疫病抗體檢測整理課件雙抗體夾心模式判定檢測線 質控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色整理課件競爭模式判定檢測線 質控線陽性不顯色顯色陰性顯色顯色整理課件SPA/G蛋白模式判定檢測線 質控線陽性顯色顯色陰性不顯色顯色整理課件膠體金免疫層析試紙質量檢測整理課件膠體金免疫層析試紙的應用 在獸藥殘留檢測中的應用 Zhang等用克倫特羅制備的單克隆抗體標記膠體金作為檢測探針，然后將偶聯 BSA的克倫特羅作為 T 線，以競爭模式組裝成試紙，用于樣品的克倫特羅殘留檢測，為我國食品安全檢測提供了有效的工具。之后 Zhang 的團隊采用同樣的模式制備并組裝成功兩類獸藥殘留檢測試紙，分別為磺胺間甲氧嘧啶、恩諾沙星殘留檢測膠體金免疫層析試紙，為我國獸藥殘留快速檢測技術的發展奠定了基礎。 在獸醫疫病檢測中的應用 Bhakar等應用相應的單抗標金，建立了阿米巴蟲抗原檢測方法。Kameyam