1、水稻OsSsr1基因的生物信息學分析摘要: OsSsr1 (GeneBank登錄號為NM_001065574)是NJH12表達譜中的一個表達量上調基因,為了進一步分析其序列特征、啟動子序列、亞細胞定位及在水稻不同組織和各種逆境脅迫下的表達模式,通過生物信息學手段對其進行分析。序列分析表明OsSsr1的開放閱讀框為2004 bp,編碼一個由667個氨基酸組成并含有5個跨膜區的蛋白,該蛋白N端含有一個信號肽。OsSsr1基因在氷稻不同不同組織中均有表達,在葉部的表達量最高,其次為根,在幼穗中的表達量最低;表達水平受干旱、高溫、高鹽、低溫、機械傷害、稻瘟病菌等的影響。前言:水稻是中國也是全世界重要的

2、糧食作物之一，鹽害是水稻生產中最不利的限制因素之一1-4。然而水稻在生長發育過程中常常受到干旱,低溫和高鹽等非生物脅迫，嚴重影響水稻的產量和品質。因此，分離鑒定水稻耐逆相關基因，培育耐逆品種，對水稻的高產穩產具有重要意義5。當植物遭受非生物脅迫時,植物會發生一系列形態、生理、化學和分子上的變化。干旱、高溫和土壤鹽漬化是最常見的非生物脅迫。全球農業用地大約22%是鹽堿地6,并且由干旱而造成的鹽堿地也在逐年增加7。植物在逆境條件下對不同環境因子響應的方式通常會重疊。盡管對麥類植物進行千旱和髙鹽處理的基因表達譜顯示,在不同的脅迫下響應的基因有所差異,但是它們可能誘導相似的防御反應8。一些研究結果表明

3、，來自水稻黃單胞菌的Harpin 蛋白質的編碼基因hrf1 轉化水稻，能夠提高其對稻瘟病、水稻白葉枯病和干旱的抗性9-11。封偉等12利用農桿菌介導法將OsSsr1 基因轉入煙草，提高了煙草在鹽脅迫下脯氨酸的積累水平和活性氧清除能力，從而增強了其對NaCl 的耐受能力。雖然過量表達OsSsr1可顯著提高轉基因植株的抗逆能力，但其序列結構特征、表達模式仍不清楚。常閃閃等5人為探明OsSsr1基因的亞細胞定位及在水稻不同組織和各種逆境脅迫下的表達模式，通過生物信息學手段、洋蔥表皮亞細胞定位、RiceXPro 數據庫和 Real-time PCR 對其進行相關的研究，得出其啟動子序列包含 TGACG

4、-motif、ABRE、TCA-element 和 W box 等多個與逆境相關的順式作用元件。GFP 融合表達顯示，OsSSR1 蛋白質定位于細胞膜。RiceXPro 數據庫中數據分析表明，OsSsr1 基因在水稻不同發育期的不同組織中均有表達，在葉中的表達量最高，胚中的表達量最低。Real-time PCR 結果表明，OsSsr1 表達水平受干旱、高溫、高鹽、低溫、機械傷害、稻瘟病菌、MeJA 和 ABA 的誘導上調。方法:查找相關文獻,找到OsSsr1的登錄號為: NM_001065574, 登錄NCBI,輸入OsSsr1(Oryza sativa L. salt-sensitive r

5、elated gene 1,)基因的登錄號,搜索OsSsr1的序列。1. 用NCBI網站上的BLAST-blastn(/Blast.cgi )進行序列比對分析。 2. 用ORF Finder（/gorf/gorf.html）進行分析，并找到序列的ORF區(開放讀碼框架)，3. 用ExPASy網站上的ProtParam（/protparam/）進行預測蛋白質的分質量和等電點。4. 用SingalP4.0（http:/www.cbs.dtu.dk/se

6、rvices/SignalP-4.0/）對OsSsr1進行信號肽預測。5. 使用TargetP（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TargetP/）對OsSsr1進行亞細胞定位分析。6. 使用 PredictProtein（/）來進行螺旋和折疊的含量分析。7. 使用NNPP（/seq_tools/promoter.html）程序預測分析OsSsr1啟動子元件。8. 使用Swiss-model（/interac

7、tive）進行同源建模預測三維結構預測和分析。9. 使用MEGA4.0軟件中的Neibor-joining算法構建系統發育樹。10. 使用TMHMM Server v2.0（http:/www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）檢測蛋白質的潛在跨膜區。11. 使用plantCARE（http:/bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線分析OsSsr1的啟動子序列結果與分析1. 在NCBI上輸入登錄號為NM_001065574時，得到OsSsr1基因的FASTA序列為下：如圖1圖12. 使用BLAST-bl

8、astn進行序列比對的結果如圖2圖2如上圖，根據顏色比例尺，hit的得分區間，與之比對結果相對較好的也就只有這4條，由于blast是區段比對，對于給定的序列，blast會把具有相識性的片段(hit)找出來，顯示的是hit的信息，所以要判斷兩個序列的相似性，單看hit值是不夠的。在Descriptions圖中看出E value 都是為0，而Oryza sativa Japonica Group cDNA clone:J013001G11, full insert sequence的score值相對來說是最大的，而Score值表示兩序列的同源性，分值越高表明它們之間相似的程度越大，所以他們兩個的相

9、似程度是最大的。3. 序列的ORF區分析，得到的結果如下。序列分析表明， OsSsr1 完整的開放閱讀框為2 004 bp， 編碼一個由 667 個氨基酸組成的蛋白質。4. 蛋白質的分質量和等電點分析如圖3、圖4.由分析結果可知：預測此蛋白質的分子量（Molecular weight）是199973.6，理論上的等電點（Theoretical pI）為4.85，氨基酸的組合大概有Ala24.8%、Cys21.6%、Gly26%、Thr27.6%。不穩定指數（）計算為42.68，所以這種蛋白質是不穩定的。脂肪指數為24.80，GRAVY的總平均為0.69。此外該蛋白質不包含任何Trp殘基，這可能

10、導致在所計算的消光系數超過10的誤差。考慮的序列的N末端為T（蘇氨酸）估計半衰期是7.2小時（哺乳動物網狀細胞，在體外），大于20小時（酵母，體內）， 大于10小時（大腸桿菌，體內）。5. 對OsSsr1進行信號肽預測分析。如下圖5、圖6所示，輸入基因的FASTA序列，得到如下的結果. 如上圖，S值表示每個氨基酸對應1個S值，在結果顯示的圖表中有一個曲線顯示S值的變化趨勢，（在full模式中可以看見具體數值），信號肽區域的S值較高。C值表示剪切位點值。每個氨基酸會有一個C值，在剪切位點處C值是最高的。Y值表示Y-max綜合考慮S值和C值的一個參數，其比單獨考慮C值要更精確。因為在一條

11、系列中C值可能有不止一個較高的位點，但是剪切位點只有一個；此時的剪切位點就由Y-max值來推測的，為S值是陡峭的位置和具有高C值的位點。在上圖中position為23和24時，C值是最大的，Y值也達到了最高峰，所以此點為信號肽的剪切位點。表1：信號肽分析結果文本Table 1: Signal peptide analysis textMeasurePositionValueCutoffsignal peptide?max. C240.291max. Y240.502max. S80.972mean S1-230.870S1-230.7010.450YES由表1可以看出1-23有信號肽， CTA

12、-CC D=0.701 ，D-cutoff=0.450而23或者24為信號肽的剪切位點。6. 對OsSsr1進行亞細胞定位分析。如圖7結果所示由圖7中的sequence預測可能的值是葉綠體，即序列包含CTP，葉綠體轉運肽; 線粒體，即序列包含MTP，靶向肽線粒體; 分泌途徑，即該序列含有SP信號肽;7. 螺旋和折疊的含量分析。結果如圖8.表2：蛋白質的二級結構組成Table 2: The composition of the protein secondary structureSec str typeHelixshEetLoop% in protein63.272.5534.18 從表二可以

13、看出蛋白質的螺旋結構占最高的含量，其次是環的含量，而折疊結構的含量最少，達到了2.55%， 上圖中紅色的表示Helix，螺旋結構； 藍色表示shEet，折疊結構；綠色表示Loop，環(轉角和無規則卷曲)。8. 分析OsSsr1啟動子元件如圖9，在框內輸入FASTA序列，得到圖10所示的結果。從圖10中可以看出啟動子預測有兩種，而從2299到2349的序列的得分最高，達到0.97（最高分為1），所以它有可能是啟動子序列：TATGGAAGGTTTAAAAGTCTCGAGAGCTCAACTGGAGATCACTACAAGAA而另一個的得分是0.93，相比第一個要小一些，排除其他因素的干擾，也有可能是啟

14、動子元件，序列為：TGCCAGCCCCTATATATATCCCAGATTTTCTCCTTCCTTTTCTCTTGACT9. 三維結構預測和分析。根據SWISS-MODEL在線建模分析得到有三種可能的模型，分別如下圖11,圖12、圖13.從圖14中可以看出，這三個模型大部分都是一樣的，只是中間的綠色部分存在較大的差異，而model #1和model # 3中的綠色部分的相似度又極高。10. 系統發育樹分析；使用MEGA4.0軟件中構建系統發育樹。得到如下結果在利用MEGA4.0軟件中的Neibor-joining算法構建系統發育樹時，發現OsSsr1與0s01g0343100、0s05g0324

15、300. 0s08g0216000與另外三個功能未知的蛋白處于同一子分支上。11. 蛋白質的潛在跨膜區分析。通過TMHMM Server v2.0在線分析得到如下圖15的結果。從圖中我們可以看出跨膜（transmembrane）只有在0-100這個位置里面有一點，而其他地方都沒有，在膜外的是最多的，由此可以看出此蛋白質的潛在跨膜區的可信度是相對較低的。12. OsSsr1基因的啟動子序列分析在plantCARE中輸入FATSTA序列，如圖16得到如圖17所示的結果；經整理得如表3所示的結果表3 OsSsr1基因啟動子順式元件預測Table3 Predicting cis-acting elem

16、ents of the OsSsr1 gene promoter調控序列名稱核心序列作用Name of regulatory sequencesCore sequenceFunctionTATA-boxTAATAcore promoterAAGAA-motifGTAAAGAAAnoABREACGTGGCcis-acting element involved in the abscisic acid responsivenessACEACGTGGAcis-acting element involved in light responsivenessCAAT-boxCAATcommon cis-a

17、cting element in promoter and enhancer regionsCAT-boxGCCACTcis-acting regulatory element related to meristem expressionbox SAGCCACCnoLAMP-elementCTTTATCApart of a light responsive elementTGACG-motifTACGGTCCis-acting regulatory element involved in the MeJA-responsivenessG-boxCACGACcis-acting regulato

18、ry element involved in light responsivenessEIRETTCGACCelicitor-responsive elementE2Fa TTTCCCGCnoSkn-1_motifGTCATcis-acting regulatory element required for endosperm expressionO2-siteGATGACATGGcis-acting regulatory element involved in zein metabolism regulationGARE-motifAAACAGAgibberellin-responsive

19、element根據NCBI上公布的日本晴全基因組序列,選取CDS區上游約1200 bp的核苷酸序列作為啟動子進行PlantCARE在線分析, 發現除含基本啟動子元件TATA-box和CAAT-box外,還含有多個與脅迫響應相關的順式作用元件,包括MeJA響應元件TGACG-motif,光響應MYB結合位點MRE;脫落酸響應元件ABRE,水楊酸響應元件TCA-element,真菌誘導響應元件Box-Wl,抗病響應兀件W box和激發子、傷、病原菌響應兀件Box S。這些結果表明:OsSsr1基因可能正是通過這些順式作用元件參與了水稻對脅迫信號傳導途徑的應答,在植物響應脅迫過程中發揮作用。討論水稻

20、是中國主要的糧食作物，然而高溫、低溫、干旱、病害和土壤鹽漬化等不良環境因素每年都會對水稻產量造成極大影響，因此，運用分子生物學技術研究其抗逆機制顯得尤為重要。其上游約1 200 bp的啟動子序列中含有多個與逆境相關的順式作用元件，當外界存在刺激時，脅迫相關轉錄因子通過調控這些誘導元件，可以迅速激活 OsSsr1 的表達，提高其蛋白質表達量，為 OsSsr1 應答逆境信號提供了依據。SingalP 預測分析顯示， OsSSR1 蛋白質 N 端有一個27個氨基酸殘基的信號肽，OsSSR1- GFP融合表達結果表明其定位于細胞膜上，推測OsSSR1可能是一個分泌蛋白質。植物在逆境條件下， 體內會發生

21、一系列變化以適應脅迫環境， 如可溶性蛋白質的增加， 細胞膜組分的改變，可溶性糖與脯氨酸含量的積累以及活性氧清除能力的增強等。OsSsr1 啟動子中含有逆境相關誘導元件，表明了OsSsr1 基因可能在水稻脅迫反應中發揮重要作用。參考文獻：1. 汪宗立,劉曉忠,王志霞. 水稻耐鹽性的生理研究: 鹽逆境下水稻品種間水分和滲透調節的差異J江蘇農業學報，1986，2( 3) : 1-102. 郭巖,陳少麟,張耕耘等. 應用細胞工程獲得受主效基因控制的水稻耐鹽突變系J. 遺傳學報，1997，24( 2) : 122-1263. ZENG L H，SHANNON M CEffects of salinity

22、 on grainyield and yield components of rice at different seeding densitiesJ. Agronomy Journal，2000，92: 418 -4234. ZENG L H，SHANNON M C Salinity effects on seedling growth and yield components of riceJ. Crop Science，2000，40: 996 -10035. 常閃閃,肖姍姍,張磊,李文奇,劉鳳權,邵敏. 水稻OsSsr1 基因的生物信息學分析、亞細胞定位及其表達模式J.江蘇農業學報，2012,28（4）：697-6986. FAO. FAO production yearbookM, 2004. FAO,Rome.7. Burke EJ, Brown SJ, Christidis N. Modeling the recent evolution of global drought and projections for the twenty-first century with the Hadley centre climate modelJ. Hydrometeor,2006,7:1113-11258. Ozturk ZN,Talame