1、第二章第二章 酶酶 Enzyme 主要內容主要內容第一節 酶的概略第二節 酶促反響機制第三節 酶促反響動力學第四節 酶活性的調理控制第五節 酶活力測定、酶的制備第一節 酶的概略一、酶的概念酶是一類由活細胞產生的，對其特異底物具有高效催化作用的蛋白質或核酸分子。二、酶學研討簡史公元前兩千多年，我國已有釀酒記載。 一百余年前，Pasteur以為發酵是酵母細胞生命活動的結果。 1878年，Kuhne初次提出 Enzyme 一詞。 1897年，Buchner兄弟用不含細胞的酵母提取液，實現了發酵。 1926年，Sumner初次從刀豆中提純出脲酶結晶。 1982年，Cech初次發現RNA也具有酶的催化活

2、性，提出核酶ribozyme的概念。1995年，發現脫氧核酶。三、酶的化學本質 1大多數酶是蛋白質 1926年美國Sumner得到脲酶的結晶，并指出酶是蛋白質. 1930年Northrop等得到了胃蛋白酶、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶的結晶，并進一步證明了酶是蛋白質。J.B.SumnerJ.H.Northrop證據：引起蛋白量變性的理化要素，可引起酶失活兩性電解質水解產生氨基酸受蛋白水解酶作用失活具有膠體的性質化學反響2核酶 1982年美國T. Cech切克等人發現四膜蟲的rRNA前體能在完全沒有蛋白質的情況下進展自我加工，發現RNA有催化活性。 Thomas Cech University of

3、Colorado at Boulder, USA Sidney Altman Yale University New Haven, CT, USA Cech和Altman阿爾特曼各自獨立地發現了RNA的催化活性，并命名這一類酶為ribozyme核酶3有些DNA也有催化活性 1995年Cuenoud等發現有些DNA分子亦具有催化活性。4抗體酶abzyme)抗體酶：指具有催化功能的抗體分子，在抗體分子的可變區即肽鏈的N端是識別抗原的活性區域，這部分區域被賦予了酶的屬性。 1986年美國Schultz和Lerner兩個實驗室同時在Science上發表論文，報道他們勝利地得到了具有催化活性的抗體。四、

4、酶促反響的特點1.酶與普通催化劑的共同點在反響前后沒有質和量的變化； 只能催化熱力學允許的化學反響； 只能加速可逆反響的進程，而不改動反響的平衡點。酶促反響具有極高的效率酶促反響具有高度的特異性酶促反響的可調理性酶促反響要求嚴厲的環境條件酶易失活2.酶促反響的特點 五、酶的專注性特異性酶的專注性是指酶對它所催化的反響及其底物具有的嚴厲的選擇性，通常一種酶只能催化一種或一類化學反響。 類型酶的專注性特異性，酶的專注性特異性，specificity 1、絕對專注性、絕對專注性absolute specificity 例例: CONH2NH2H2O脲脲酶酶CO2 + 2NH3CONH2NHCH3H2

5、O脲脲酶酶X1族專注性基團專注性，族專注性基團專注性，group specificity 相對專注性相對專注性relative specificity A B 或或 A B如如-D-葡萄糖苷酶葡萄糖苷酶 OCH2OHOHOHOOHR2鍵專注性鍵專注性 A BR1COOR2+ H2O酯酯酶酶R1COOH + R2OH3、立體專注性、立體專注性stereospecificity 1D-，L-立體異構專注性立體異構專注性 2幾何異構專注性幾何異構專注性 CCHHHOOCCOOH+ H2O延延胡胡索索酸酸水水化化酶酶CH2COOHCHOHCOOH3酶能區分從有機化學觀念來看是屬于對稱分子中兩個等酶能區

6、分從有機化學觀念來看是屬于對稱分子中兩個等 同的基團，只催化其中的一個基團，而不催化另一個。同的基團，只催化其中的一個基團，而不催化另一個。 例例1： CH2OHCHCH2OHHO14+ ATP甘甘油油激激酶酶CH2CHCH2OHHO14OP+ ADP假設甘油激酶不能區分兩個假設甘油激酶不能區分兩個CH2OH基團，那么會生成基團，那么會生成 :CH2CHCH2OHHO14OPCH2OHCHCH2HO14OP和和例例2： DC OHDH3C+NCHCONH2R+4NAD+ D（重氫）- DNCCONH2R4NAD 輔輔酶酶的的還還原原型型HD( ( A型型 ) )+H3CCDO六大類酶催化反響的

7、性質六大類酶催化反響的性質 氧化復原酶類氧化復原酶類oxido-reductases 催化氧化復原反響的酶，包括氧化酶類、催化氧化復原反響的酶，包括氧化酶類、脫氫酶類、過氧化氫酶、過氧化物酶等。脫氫酶類、過氧化氫酶、過氧化物酶等。 1氧化酶類：催化底物脫氫，并氧化生成氧化酶類：催化底物脫氫，并氧化生成H2O或或H2O2 。鄰苯二酚氧化酶鄰苯二酚氧化酶EC 1.10.3.1，鄰苯二酚：氧氧化酶，鄰苯二酚：氧氧化酶 鄰苯二酚鄰苯二酚鄰苯醌鄰苯醌OHOH+ O2鄰鄰苯苯二二酚酚氧氧化化酶酶OO2+ 2H2O22脫氫酶類：直接催化底物脫氫脫氫酶類：直接催化底物脫氫 A2H + B A + B2H 例：

8、乳酸脫氫酶例：乳酸脫氫酶EC 1.1.1.27，L-乳酸：乳酸：NAD+氧化復原酶氧化復原酶 乳酸乳酸丙酮酸丙酮酸COOHC HCH3H O+ NAD+COOHCOCH3+ NADH + H+乳乳酸酸脫脫氫氫酶酶轉移酶類轉移酶類transferases 催化基團的轉移催化基團的轉移 AR+ BBRA +例：谷丙轉氨酶例：谷丙轉氨酶GPTEC 2.6.1.2，L-丙氨酸：丙氨酸： 酮戊二酸氨基轉移酶酮戊二酸氨基轉移酶 水解酶類水解酶類hydrolases AB + H2O AOH + BH 裂合酶類裂合酶類lyases 從底物移去一個基團而構成雙鍵或逆反響從底物移去一個基團而構成雙鍵或逆反響 A

9、B A + B 例例1：例例2：異構酶類異構酶類isomerase 催化異構化反響催化異構化反響 例：例：AB銜接酶類銜接酶類ligases, 也稱也稱synthetases合成酶類合成酶類 將兩個小分子合成一個大分子，通常需求將兩個小分子合成一個大分子，通常需求ATP供能。供能。 例：例： 乙酸+CoASH+ATP 乙酰SCoA+AMP+PPiA + B + ATP AB + ADP + PiA + B + ATP AB + AMP + PPi銜接酶異構裂合水解2.根據酶的分子組成結合酶各部分作用： 酶蛋白:決議反響特異性 輔助因子：決議反響種類和性質輔助因子-金屬離子 A.穩定酶蛋白構象：

10、穩定酶蛋白催化活性所必穩定酶蛋白構象：穩定酶蛋白催化活性所必需的分子構象需的分子構象B.構成酶的活性中心：作為酶的活性中心的組構成酶的活性中心：作為酶的活性中心的組成成分，參與構成酶的活性中心成成分，參與構成酶的活性中心C.銜接作用：作為橋梁，將底物分子與酶蛋白銜接作用：作為橋梁，將底物分子與酶蛋白螯合起來螯合起來D.傳送電子、原子或基團傳送電子、原子或基團E.中和陰離子，降低反響中的靜電斥力中和陰離子，降低反響中的靜電斥力輔助因子-小分子有機化合物 主要作用是參與酶的催化作用，在催化中起著原子、電子或某些化學基團的傳送。 種類很多，分子構造中常含有維生素或維生素類物質共價結合3.根據酶的構造

11、v單體酶 通常為一條多肽鏈，但也有由二硫鍵相連的多條多肽鏈的情況。v寡聚酶 兩個或兩個以上亞基組成的酶v多酶復合體有幾種功能相關的酶靠非共價鍵彼此嵌合構成的一個復合物稱為多酶復合體。v多酶體系 在完好細胞內的某一代謝過程中，由幾個酶構成的反響體系。多酶體系的存在添加了整個代謝反響的催化效率，同時便于機體對酶的調控。七、酶的命名 根據國際酶學委員會的建議，每個酶允許有兩個稱號：習慣名和系統名。1. 習慣命名法：底物名 + “酶 如淀粉酶有時在名字前加上酶的來源。 如胃蛋白酶反響性質+“酶 如水解酶 習慣名普通比較簡短，運用方便；但缺乏系統性，不夠準確，有時會一酶數名或一名數酶的景象。 2. 系統

12、命名法 底物名 + 反響類型 + “酶 假設底物二個或二個以上，那么一切底物都需寫出，各底物間以冒號隔開。假設底物中有水，可省略。一切底物的構型都應標明。反響類型指酶學委員會規定的六種。 例如 “乳酸脫氫酶的系統名為“L-乳酸 : NAD+氧化復原酶酶的標碼: 國際酶學委員會規定，每個酶都有獨一的特定標碼。 如乙醇脫氫酶的編碼是：EC1.1.1.1第一個“1 第1大類，即氧化復原酶類；第二個“1 第1亞類，供氫體為CHOH；第三個“1 第1亞亞類，受氫體為NAD+；第四個“1 在亞亞類中的順序號 又如乳酸脫氫酶的編碼是：EC1.1.1.27 第二節 酶促反響機制活性中心的基團均屬必需基團，但必

13、需基團還包括活性中心以外的其他一些基團，它們在維持酶的空間構造、酶活性的調理、免疫等方面起著重要的作用。一、 酶的活性部位1. 酶的活性中心有必需基團組成的，具有一定空間構造的，直接與底物結合，并與酶催化作用直接有關的構造區域微區稱為酶的活性中心.2.必需基團l與酶活性有關的基團叫必需基團essential group l酶分子中氨基酸側鏈的化學基團中，一些與酶活性親密相關的化學基團 活性中心活性中心active center外的必需基團外的必需基團必需基團必需基團 結合基團：與底物相結合結合基團：與底物相結合 活性中心內的必需基團活性中心內的必需基團 催化基團：催化底物轉化成產物催化基團：催

14、化底物轉化成產物 活性中心外的必需基團維持酶活性中心應有的空間構象或作為調理劑的結合部位所必需。例：胰凝乳蛋白酶的肽鏈折疊示活性中心 結合部位：底物在此與酶分子結合。一個酶的結合部位又可以分為各種亞位點，分別與底物的不同部位結合。催化部位：底物的敏感鍵在此被打斷或構成新的鍵，從而發生一定的化學反響。一個酶的催化部位可以不止一個。3.酶的活性中心的特點 都是酶分子外表的一個凹穴，有一定的大小和外形，但它們不是剛性的，在與底物接觸時表現一定的柔性。 活性部位為非極性的微環境，這有利于與底物的結合。在活性中心內還含有少數極性基團直接與底物相作用。溶菌酶活性中心為一裂痕，可以包容肽多糖的六個單糖基，并

15、與之構成氫鍵和范德華力。結合基團是101位的天冬氨酸和108位的色氨酸催化基團是35位的谷氨酸和52位的天冬氨酸。二、酶促反響機理活化分子：反響中能量較高的、能發生有效碰撞的分子，叫做活化分子活化能：在一定溫度下，1摩爾底物全部進入活化態所需求的自在能。單位kJ/mol 酶的催化機理是降低活化能例例 2H2O22H2O+O2 反反 應應活化能活化能非催化反應非催化反應75.24kJ/mol鈀催化反應鈀催化反應48.9kJ/molH2O2酶催化酶催化8.36kJ/mol三、中間產物學說 酶催化時，酶活性中心首先與底物結合生成一種酶-底物復合物ES，此復合物再分解釋放出酶，并生成產物。 普通化學反

16、響歷程：普通化學反響歷程： S P 酶促反響歷程：酶促反響歷程： S + E ES E + P四、 誘導契合學說INDUCED-FIT HYPOTHESIS 1958年Koshland提出“誘導契合學說： 酶分子活性中心的構造原來并非和底物的構造相互吻合，但酶的活性中心是柔性的而非剛性的。當底物與酶相遇時，可誘導酶活性中心的構象發生相應的變化，其上有關的各個基團到達正確的陳列和定向，因此使底物和酶能完全契合，結合成中間絡合物，并有利于催化反響的進展。當反響終了后產物從酶上零落下來后，酶的活性中心又恢復了原來的構象。五、與酶的高效率催化有關的要素 1臨近效應與定向效應臨近效應：指酶和底物結合構成

17、中間復合物時，底物分子之間，酶的催化基團與底物之間結合與同一分子，使有效濃度添加，從而使反響速率添加的效應兩個反響的分子，它們反響的基團需求相互接近，才干反響。 定向效應: 指酶的催化基團與底物的反響基團之間的正確定向。 2張力效應和底物的形變 3廣義的酸堿催化v酸堿催化：瞬時向反響物中提供質子或從反響物中提供質子以穩定過渡態，加速反響。v狹義的酸堿催化：在水溶液中經過高反響性的H+離子或OH -離子對化學反響速度表現出的催化作用。v廣義的酸堿催化：經過H+離子或OH -離子及能提供H+離子或OH -離子的供體進展的催化v 組成酶活性中心的極性基團，在底物的變化中起質子的供體或受體的作用。v酶

18、活性中心處可以提供質子或接受質子而起廣義酸堿催化作用的功能基團有：v 谷氨酸、天冬氨酸側鏈上的羧基v 絲氨酸、酪氨酸中的羥基v 半胱氨酸中的巰基v 賴氨酸側鏈上的氨基v 精氨酸中的胍基v 組氨酸中的咪唑基 4共價催化它是指酶活性中心處的極性基團，在催化時，能分別放出電子或汲取電子并作用于底物的缺電子中心或負電中心，迅速構成不穩定的共價中間復合物，降低反響活化能，使反響加劇。根據活性中心處極性基團對底物進攻的方式不同，共價催化可分為親電催化與親核催化兩種。 v活性中心處的親核基團有：v 絲氨酸的羥基v 半胱氨酸的巰基v 組氨酸的咪唑基v底物上典型的親電中心：磷酰基、酰基、糖基特別留意：組氨酸的咪

19、唑基既是很強的親核基團，又是有效的廣義酸堿功能基團。v 影響酸堿催化反響速度的要素有兩個v第一個是酸堿的強度：在這些功能基團中，組氨酸的咪唑基的解離情況pK值為6.0，在生理pH條件下，既可以作質子的供體又可作質子的受體。因此，咪唑基是催化中最有效最活潑的一個催化功能基團；v第二個是這些功能基團供出質子或接受質子的速度，其中的咪唑基的情況特別突出，它供出或接受質子的速度非常迅速，其半衰期小于10-10秒。而且，供出或接受質子的速度幾乎相等。由于咪唑基有如此的優點，所以雖然組氨酸在大多數蛋白質中含量很少，卻很重要，在許多酶的活性中心處都含有組氨酸。推測很能夠在生物進化過程中，它不是作為普通的構造

20、蛋白成分，而是被選擇作為酶分子中的催化構造而存在下來的。具有酸堿催化特征的酶促反響，酶與底物結合成的中間產物是離子型絡合物。使底物靠攏使底物分子產生應力使底物分子電荷變化 5. 金屬離子催化 6. 多元催化和協同效應 7. 活性部位微環境的影響留意：一種酶的催化反響經常是多種催化機制的綜協作用，這是酶促反響高效率的重要緣由 第三節第三節 酶促反響動力學酶促反響動力學KINETICS OF ENZYME-CATALYZED REACTION l 酶促反響動力學:研討各種要素對酶促反響速率的影響，并加以定量的論述。酶促反響速度的測定影響要素包括有： 酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。

21、 研討一種要素的影響時，其他各要素均恒定。一、酶濃度對反響速度的影響 l 當反響系統中底物的濃度足夠大時，酶促反響速度與酶濃度成正比，即=kE。l 二、溫度對反響速度的影響 l 普通來說，酶促反響速度隨溫度的增高而加快。但當溫度添加到達某一點后，由于酶蛋白的熱變性作用，反響速度迅速下降，直到完全失活。 l酶促反響速度隨溫度升高而到達一最大值時的溫度就稱為酶的最適溫度。 三、PH對反響速度的影響 l 察看pH對酶促反響速度的影響，通常為一“鐘形曲線，即pH過高或過低均可導致酶催化活性的下降。 l 酶催化活性最高時溶液的pH值就稱為酶的最適pH。q最適pH (optimum pH)：q酶催化活性最

22、大時的環境pH。0酶活性 pH胃蛋白酶 淀粉酶 膽堿酯酶 246810一底物對酶促反響的飽和景象：研討前提：單底物、單產物反響 酶促反響速度普通在規定的反響條件下，用單位時間內底物的耗費量和產物的生成量來表示 反響速度取其初速度，即底物的耗費量在5以內的反響速度 底物濃度遠遠大于酶濃度四、底物濃度對反響速度的影響 當底物濃度較低時：反響速率與底物濃度呈正比；反響為一級反響隨底物濃度添加：反響速率不再呈正比例添加反響為混合級反響當底物濃度高達一定程度：反響速率不再添加；反響為零級反響在其他要素不變的條件下，底物濃度對反響速率的影響呈矩形雙曲線型 二米氏方程式的推導l Michaelis &

23、; Menten 于1913年推導出了上述矩形雙曲線的數學表達式，即著名的米氏方程(Michaelis equation) 。 l SKSVvmmax V 不同的底物濃度時的反響速率；S 底物濃度；Vmax 最大反響速率；Km 米氏常數 Michaelis-Menten的三個假設：的三個假設： (1)推導的推導的v為反響初速度為反響初速度 產物的生成量很少產物的生成量很少 k2的反響忽略不計。的反響忽略不計。 (2)反響體系處于穩態反響體系處于穩態 即即ES不變不變 ES的生成量的生成量 = ES的分解量的分解量(3)S E S ES 1kES 1kES2kEP ESEt SESES生成速度：

24、生成速度： SESEkvt11，ES分解速度：分解速度：ESkESkv212當酶反響體系處于恒態時：當酶反響體系處于恒態時：21vv 即：即： ESkESkSESEkt211 121kkkESSESSEt令：令：Kmkkk121那么那么： SSESESKmtE(1)經整理得：經整理得： SKSEmtES由于酶促反響速度由由于酶促反響速度由ES決議，即決議，即ESkv22kvES，所以，所以(2)將將2代入代入1得：得： SKSEkvmt2 SKSEkmt2v(3)當當Et=ES時，時，mVv tmEkV2(4)所以所以 將將4代入代入3，那么：，那么： SKSVvmmax米氏方程的推導恒態法三

25、KM的意義：v1. Km值等于酶促反響速度值等于酶促反響速度為最大反響速度一半時的為最大反響速度一半時的底物濃度，單位是底物濃度，單位是mol/L。即當即當=Vmax/2時，時，Km=S。v2. Km值的大小可以近似反響酶與底物親和力的大小。Km越小，酶與底物的親和力越大。 v3.可用于判別反響級數：當S100Km時，=Vmax，反響為零級反響；當0.01KmSE。 二、酶的制備二、酶的制備1、工業上大多采用、工業上大多采用微生物發酵法來獲得微生物發酵法來獲得大量的酶制劑大量的酶制劑.2、分別純化酶的方、分別純化酶的方法：鹽析法、有機溶法：鹽析法、有機溶劑沉淀法、吸附法。劑沉淀法、吸附法。三三 、酶的分別純化、酶的分別純化1選材：酶含量高的資料選材：酶含量高的資料2破碎細胞：機械破壁，化學破壁破碎細胞：機械破壁，化學破壁 酶破酶破壁壁 溫度破壁等溫度破壁等3抽提：緩沖液抽提：緩沖液4去核酸、去多糖去核酸、去多糖5純化：提取蛋白質方法純化：提取蛋白質方法6保管：低溫枯燥保管保管：低溫枯燥保管酶的特殊性，在提純過程中要留意酶的特殊性，在提純過程中要留意 :1全部操作在低溫全部操作在低溫04。 2在分別提純過程中，不能猛烈攪拌