1、微生物飼料添加劑 乳酸菌的微生物學檢驗 www.飼料檢測網.中國www. 飼料檢測網.cn一、概述乳酸細菌是一類能利用發酵糖產生大量乳酸的細菌通稱。乳酸細菌主要包括23個屬，通常在飼料中用作有益微生物的菌種有干酪乳桿菌（Lactobacillus casei）、植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）、糞腸球菌(Enterococcus faecium)、乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)、兩歧雙歧桿菌(Bifidobacterium bifidum)、屎腸球菌（Enterococ

2、cus faecium）、乳酸乳桿菌(Lactococcus Lactis)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)等。乳桿菌常用MRS瓊脂作半選擇培養基。APT培養基通常用于分離綠色乳桿菌和其他乳桿菌及肉食桿菌。當乳桿菌僅是復雜區系中的部分菌類時，SL培養基常用作為選擇性培養基。對于芽孢乳桿菌常用GYP培養基，鏈球菌有TYC培養基、MS培養基，還有利用磺胺二甲惡唑、制大腸菌素和結晶紫等作為選擇因子。M17培養基被用作乳球菌的分離培養基。此外還有如溴甲酚紫培養基、CHALMERS培養基等也常用于乳酸菌的分離。以下舉幾個例子來說明乳酸菌的作用及特性。嗜酸乳桿菌屬于乳桿菌屬（

3、Lactobacillus）的一個種。其特性為：桿菌，兩端圓，不運動，無鞭毛，接觸酶陰性，和苦杏仁苷、纖維二糖、七葉靈、果糖、半乳糖、葡萄糖、乳糖、麥芽糖、甘露糖、水楊苷、蔗糖反應為陰性，阿拉伯糖、葡糖酸鹽、甘露醇、松三糖、鼠李糖、核糖、山梨糖、木糖反應為陰性。由于嗜酸乳桿菌在生長中可以產生一些抑菌物質，如有機酸、細菌素及類細菌素，可以抑制腸道中有害微生物生長繁殖，起到平衡腸道菌群的作用。并能產生B族維生素，包括各種葉酸、生物素、維生素B6和維生素K等，分泌各種有益物質，如乳酸、乙酸等，降低腸道pH值。糞腸球菌主要存在于人類或動物腸道，是人類和動物腸道的正常菌群等。糞腸球菌為革蘭氏陽性，圓形或

4、橢圓形，能在膽汁七葉苷瓊脂上生長，不產生色素。乳酸片球菌細胞呈球狀，直徑0.61.0m，在直角兩個平面交替形成四聯狀，一般細胞成對生，單生者罕見，不成鏈狀排列。革蘭氏陽性，不運動，兼性厭氧。在MRS培養基上菌落小，呈白色。沿洋菜穿刺線的生長物呈絲狀，接觸酶陰性，不產細胞色素，在不加啤酒花的麥芽汁中生長，能利用半乳糖、阿拉伯糖、木糖和海藻糖產酸，不分解蛋白質，不產吲哚，不水解馬尿酸鹽。某些菌株能利用蔗糖和乳糖產微量的酸。不能利用麥芽糖、甘露醇、糊精等產酸，能產丁二酮。二、檢測方法1 范圍本方法規定了微生物飼料中各乳酸菌(包括干酪乳桿菌、植物乳桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌、嗜酸乳桿菌、乳酸乳桿菌、戊糖

5、片球菌)及其總數的測定及鑒定方法。本方法適用于微生物飼料中乳酸菌的檢測。2 術語：乳酸菌：一群能分解葡萄糖或乳糖產生乳酸，需氧和兼性厭氧，多數無動力，過氧化氫酶陰性，革蘭氏陽性的無芽胞桿菌和球菌。乳酸菌菌數總數：試料在一定條件下培養后，所得1 mL試料中所含乳酸菌菌落的總數。3 設備和材料3.1 恒溫培養箱：36±1。3.2 冰箱：04。3.3 恒溫水浴：46±13.4 電爐：可調式。3.5 吸管：容量為1、10、25 mL。3.6 廣口瓶或三角瓶：容量為500 mL。3.7 平皿：直徑為9 cm。3.8 試管：18×180 mm。3.9 顯微鏡。3.10高壓滅菌

6、鍋。3.11烘箱。4 培養基和試劑4.1 改良TJA培養基（改良番茄汁瓊脂培養基）。4.2 改良MC培養基（Modified Chalmers培養基）。4.3 0.1%美蘭牛乳培養基。4.4 6.5%氯化鈉肉湯。4.5 pH9.6葡萄糖肉湯。4.6 40%膽汁肉湯。4.7 淀粉水解培養基。4.8 精氨酸水解培養基。4.9 乳酸桿菌糖發酵管。4.10 七葉苷培養基。4.11 革蘭氏染色液。4.12 3%過氧化氫溶液。4.13 蛋白胨水、靛基質試劑。4.14 明膠培養基。4.15 硝酸鹽培養基、硝酸鹽試劑。4.16 生理鹽水：將蒸餾水加入8.5 g的食鹽中做成1000 mL的溶液。在121下滅菌1

7、5min。5 乳酸菌菌落總數的測定5.1 檢驗程序乳酸菌菌落總數檢驗程序如下：試料作成幾個適當倍數的稀釋液選擇23個適當稀釋度，各以1 mL之量加入滅菌平皿內每皿內加入適量改良TJA或改良MC培養基72±136±1菌落計數報告圖：乳酸菌檢測程序圖5.2 操作步驟5.2.1 以無菌操作將經過充分搖勻的試料25 mL（或25 g）放入含有225 mL滅菌生理鹽水的滅菌廣口瓶內作成1:10的均勻稀釋液。5.2.2 用1mL滅菌吸管吸取1:10稀釋液1 mL，沿管壁徐徐注入含有9 mL滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖端不要觸及管內稀釋液）。5.2.3 另取1 mL滅菌吸管，按上述操

8、作順序，作10倍遞增稀釋液，如此每遞增一次，即換用1支1 mL滅菌吸管。5.2.4 選擇23個以上適宜稀釋度，分別在作10倍遞增稀釋的同時，即以吸取該稀釋度的吸管移1 mL稀釋液于滅菌平皿內，每個稀釋度作兩個平皿。5.2.5 稀釋液移入平皿后，應即時將冷至50的乳酸菌計數培養基（改良TJA或改良MC）注入平皿約15 mL，并轉動平皿使混合均勻。同時將乳酸菌計數培養基傾入加有1 mL稀釋液試料用的滅菌生理鹽水的滅菌平皿內作空白對照，以上整個操作自培養物加入培養皿開始至接種結束須在20 min內完成。5.2.6 待瓊脂凝固后，翻轉平板，置36±1恒溫培養箱內培養72±1 h取出

9、，觀察乳酸菌菌落特征（見表1），選取菌落數在30300之間的平板進行計數。5.3 乳酸菌在改良TJA和改良MC培養基上菌落生長形態特征見表1。表1 乳酸菌菌落特征改良TJA改良MC桿菌平皿底為黃色，菌落中等大小，微白色，濕潤，邊緣不整齊，直徑3±1mm，如棉絮團狀菌落。平皿底為粉紅色，菌落較小，圓形，紅色，邊緣似星狀，直徑2±1mm，可有淡淡的暈。球菌平皿底為黃色，菌落光滑，濕潤，微白色，邊緣整齊。平板底為粉紅色，菌落較小，圓形，紅色，邊緣整齊，可有淡淡的暈。注：干酪乳桿菌在改良TJA培養基上為圓形光滑，邊緣整齊，側面呈菱形狀，6 乳酸菌的鑒定進行革蘭氏染色，顯微鏡檢查，并

10、做過氧化氫酶試驗。革蘭氏陽性，過氧化氫酶陰性，無芽胞的球菌或桿菌可定為乳酸菌。對上述分離到的乳酸菌需進行菌種鑒定，則作以下試驗。6.1 菌種制備：自平板上挑取菌落，接種于改良TJA或改良MC瓊脂斜面，于36±1，2448 h培養，刮取菌苔，分別進行下列試驗。6.2 乳酸桿菌鑒定試驗：極少見還原硝酸鹽，不液化明膠，不產生靛基質和硫化氫。6.3幾種乳桿菌屬內種的碳水化合物反應，見表2。6.4腸球菌的鑒別試驗，見表3。6.5 腸球菌屬與片球菌屬容易混淆，其鑒別可見表4。表2 常見乳桿菌屬內種的碳水化合物反應七葉苷纖維二糖麥芽糖甘露醇水楊苷山梨醇棉籽糖蔗糖干酪乳桿菌+d+-d嗜酸乳桿菌+-+-d+植物乳桿菌+注：d有些菌株陽性，有些菌株陰性；#弱、慢或陰性。表3 腸球菌的鑒別表名稱-半乳糖苷酶L-阿拉伯糖甘露醇蜜二糖山梨醇丙酮酸發酵糞腸球菌-+-D+屎腸球菌VVVVD-注：D+，通常陽性；D-，通常陰性；V，不同或可變。表4 鏈球屬與片球菌屬的鑒別特征鏈球菌屬片球菌屬細胞形態球或卵圓形球形排列成對，鏈四聯，成對接觸酶-d厭氧條件下生長良好+從葡萄糖產氣-抗萬古霉素-+注：d有些菌株陽性，有些菌株陰性。7 結果計算及表述7.1 乳酸菌總數菌落計數后，隨機挑取5個菌落進行鑒定。根據證實為乳酸菌菌落計算出該皿內的乳酸菌數，然后乘其