1、微囊藻毒素對孵化7天、9天和11天鴨胚肝臟的毒性影響摘要：藍藻類是被認為生物進化過程中最早進入陸地的生物，并在自然界中廣泛分布。近年來， 由于工業及生活的污染日趨嚴重，致使水體富營養化加劇，藍藻大量繁殖。這不僅破壞的原有的生 態平衡，而且其所產生的微囊藻毒素(Microcysti n, MC)對動物及人類的健康構成了一定的威脅,因此也越來越受到人們的關注。本研究以櫻桃谷鴨胚為材料，通過石蠟組織切片技術觀察櫻桃谷鴨 胚肝臟的組織變化，研究微囊藻毒素對櫻桃谷鴨胚肝臟的影響。研究表明，微囊藻毒素對鴨胚的肝 臟造成了明顯的損害。關鍵詞：微囊藻毒素，鴨胚，肝臟Toxic Effects of Micro

2、cystins on 7 Day 9 Day and 11 DayDuck Liver08092206HAN Xia ng-Ru(School of Life Scienee , Huzhou Teachers College, Huzhou 313000 )Abstract: Cyanobacteria class is considered to be the first to enter the process of biological evoluti on of orga ni sms on land, and widely distributed in n ature .In re

3、ce nt years, in dustrial and domestic polluti on worse ning result in in creased eutrophicati on and algae blooms. This is not only destroy the ecological balanee of the original, but the microcystin (Microcystin, MC) it produced which also is a threatean to animal and human. So it gains more and mo

4、re attention in public. This study used Cherry Valley duck embryos via the tech no logy of paraffi n tissue to observe cha nges in it' liver tissue, and to study the effects of microcysti n on Cherry Valley duck embryo liver. This results showed that microcyst in caused sig ni fica nt damage on

5、duck embryo liver.Key words: microcyst ins, duck, liver1引言 12材料與方法 12.1實驗材料 12.1.1藻種2.1.2 ELISA 試劑盒2.1.3種鴨蛋2.1.4化學藥品和試劑2.1.5主要儀器和設備2.1.6其他實驗用具2.1.7酶標儀設置2.1.8主要試劑的配制2.1.9載玻片的預處理2.2實驗方法及步驟 32.2.1藍藻毒素的提取2.2.2微囊藻毒素的ELISA檢測2.2.3櫻桃谷蛋的處理2.2.4鴨胚微囊藻毒素的處理2.2.5石蠟組織切片的制備 2.2.6顯微觀察、采圖2.2.7數據處理3結果 103.1微囊藻毒素的檢測結果

6、 103.2鴨胚的藻毒素處理結果 113.2.1櫻桃谷種鴨蛋的平均重量322鴨胚的死亡情況323鴨胚胎發育過程與解剖特征3.3 MC肝組織切片觀察結果 133.3.1 MC對肝臟的形態影響3.3.2 MC處理的肝臟組織觀察4討論 155總結與展望 16參考文獻 16致謝 181.引言隨著工農業的迅速發展，大量富含氮、磷等營養元素的工農業廢水排入水體中，引起水體富營養化日趨嚴重，導致藻類特別是藍藻的異常繁殖生長，從而出現藍藻的水華現象。目前，藍藻水華發生的頻率和嚴重程度都呈現迅猛的增長趨勢，發生地則遍布全球各地1-3。藍藻水華的主要危害是有毒藍藻細胞破裂后能釋放多種不同類型的藻毒素，其中最為常見

7、的是微囊藻毒素（Microcystin.MC）。MC是一類具有生物活性的七肽單環毒素，主要由銅綠微囊藻（ Microcystis aeruginosa）、魚 腥藻（Anabaena）和顫藻（Oscillatoria ）等產生。目前，已發現的 MC有80多種，以 MC-LR、 RR和YR最為常見（L、R、Y分別代表亮氨酸、精氨酸和酪氨酸） ，其中以MC-LR含量較高、毒 性最大。MC是一種具有自我強化機制作用的生態生長調節素，高濃度的MC不僅可以影響水生植物種群的多樣性6，而且可以導致魚卵變形、蚤類死亡、魚類行為和生長異常及死亡。近年來，世界各 地由于藍藻水華而引起魚類、家畜和野生動物死亡的報道

8、屢見不鮮，甚至有因醫用透析用水中存在MC而導致透析病人死亡的案例8。經進一步研究發現，肝臟是MC主要的靶器官，由于MC具有較強的肝毒性，并對心、腎及胃腸也有一定的毒性9，其對動物和人類均有一定的毒害作用，且動物和人類若直接接觸或飲用含 MC的水，可引起中毒。動物的中毒癥狀主要有肌肉痙攣、呼吸急促、腹瀉、昏迷，中毒嚴重者在數小時至數天死亡；人類接觸到含MC水后，會引起皮膚及眼睛過敏、發熱、疲勞、急性腸胃炎，長期接觸則會誘發皮膚癌、肝炎及肝癌，甚至導致死亡10。本課題在實驗室條件下，以櫻桃谷鴨胚為研究對象，孵化至第3天，在其卵黃部位注入 MC,然后立即用石蠟封口，繼續孵化。孵化至 7天、9天和11

9、天，取其肝臟組織，進行 HE染色和組織 石蠟切片，觀察對比實驗組與對照組組織的情況，研究MC對肝臟組織的毒性影響。2.材料與方法2.1實驗材料2.1.1藻種（訂購于中國科學院水生生物研究所）（訂購于中國科學院水生生物研究所）（Beacon公司生產）（購于湖州塘甸建華種禽廠）1、 FACHB-910Microcystis aeruginosa2、 FACHB-911Microcystis aeruginosa2.1.2 ELISA 試齊U盒微囊藻毒素檢測試劑盒2.1.3種鴨蛋櫻桃谷種鴨蛋2.1.4化學藥品和試劑化學藥品和試劑見表2- 1所列:表2-1主要的化學藥品和試劑名稱純度來源乙酸分析純上海

10、申汕化工有限公司甲醇分析純上海試劑總廠丙酮分析純浙江杭州蕭山化學試劑廠甲醛分析純浙江三鷹化學試劑有限公司二甲苯分析純國藥集團化學試劑有限公司磷酸二氫鈉試劑國藥集團化學試劑有限公司磷酸氫二鈉試劑國藥集團化學試劑有限公司冰醋酸分析純浙江三鷹化學試劑有限公司無水乙醇分析純杭州蕭山化學試劑廠95%乙醇分析純杭州蕭山化學試劑廠APES試劑福州邁新生物技術開發有限公司中性樹脂試劑國藥集團化學試劑有限公司蘇木色精試劑北京拜爾迪生物公司伊紅Y （水溶性）材料國藥集團化學試劑有限公司石蠟（熔點是 60-62 C）試劑上海經濟區如皋市紅旗玻璃廠2.1.5主要儀器和設備主要的儀器和設備見表2-2所列:表2-2主要儀

11、器設備名稱型號制造商或產地生物體視顯微鏡S27日本OLYMPUS公司海信BCD 206H冰箱海信集團有限公司JY96- n超聲波細胞粉碎機寧波新芝生物股份有限公司伯樂680型酶標儀BIO-RAD 公司電子天平梅特勒一托利多儀器（上海）有限公司himac CR21G立式大容量高速速離心機日立公司Grumbach孵化器南京皓海儀器儀表有限公司生物組織切片機 RM 2235德國LEICA公司電熱鼓風干燥箱 101A-2上海浦東榮豐科學儀器有限公司超級恒溫水槽 DKB-501A上海森信實驗儀器有限公司普通顯微鏡 MOTIC B series廈門麥克奧迪光學儀器有限公司生物相差顯微鏡 MOTIC BA

12、400廈門麥克奧迪光學儀器有限公司2.1.6其他實驗用具眼科鑷子，解剖刀，解剖針，解剖剪，溫度計，EP管，移液槍，鉛筆，培養皿，切片盒，染色缸,染色架，吸水紙，標簽紙，蠟杯，蠟鏟，酒精燈,吸水紙，切片刀，毛筆，磨砂載玻片，展片臺,蓋玻片，樹膠，滴官，各種量程的燒杯、量筒及容量瓶，臉盆，1000mL燒杯，500mL的燒杯，1000mL容量瓶，500mL容量瓶，100mL量筒，50mL量筒，5mL移液管，1mL移液管，錐形瓶，蒸餾水瓶，培養瓶，膠頭滴管，試管，一次性注射器。2.1.7酶標儀設置“00000后, 接上電源，打開機器后面的開關，機器開啟自檢后，根據儀器上的提示輸入密碼 按輸入鍵即可進入

13、機器的操作界面。 在電腦屏幕上打開酶標儀軟件，如果試驗的程序已編好，則可直接調出在儲存的程序 直接讀板。如試驗的程序需重新編輯，則選擇添加新檢測項目進行新程序的設置。由于是定量實驗選擇定量后，根據試劑盒所配進行標準品濃度設置。 選擇單波長，450 nm。讀數的方式為步進。存為模板 排板：手工排板，按照檢測中個樣品的排列方式準確設置各孔，并設置一個空白孔。 檢測品放入酶標儀，按讀板，即可檢測。2.1.8主要試劑的配制 新潔爾滅溶液配制：按水與苯扎溴銨體積比100:1混合配的，現配現用。4%中性甲醛（10%中性福爾馬林）固定液的配制：稱取磷酸氫二鈉16.4g，磷酸二氫鈉4.0g，各自溶解后混合在一

14、起，加入甲醛（40%） 100mL ,加蒸餾水定容至1000mL，倒入染色缸中室溫保存。 乙醇-甲醛（酒精-福爾馬林，AF ）固定液的配制：量取甲醛（40%） 100mL和95%乙醇900mL，倒入染色缸中室溫保存。蘇木精液的配制：稱取蘇木精2g,硫酸鋁鉀17g,碘酸鈉0.2g，量取無水乙醇250mL ,蒸餾水750mL ,冰醋酸20mL。 先用無水乙醇溶解蘇木精，用蒸餾水溶解硫酸鋁鉀，然后將該兩液混合，加入碘酸鈉待溶液變成紫 紅色時，再加入冰醋酸，混勻倒入染色缸中室溫保存。0.25% -0.5%伊紅Y水溶性的配制：稱取伊紅Y0.5g，加蒸餾水100mL，加冰醋酸1滴，混勻倒入染色缸中室溫保存

15、。70%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取70mL ,然后加入蒸餾水至100mL o80%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取80mL ,然后加入蒸餾水至100mL o90%酒精配制：先將濃度為100%的酒精注入量筒，取90mL,然后加入蒸餾水至100mL o2.1.9載玻片的預處理組織切片貼在載玻片上進行免疫組織化學染色，由于染色工程操作步驟及沖洗次數較多，容易 出現脫片現象，因此將載玻片涂膠或硅化是必要的。較常用較好的是采用硅化玻片。硅化玻片的制 備：APES現用現配，將干凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的 APES中，停留20 -30秒鐘，取出稍停片刻，再入純丙酮

16、溶液或蒸餾水中洗去未結合的APES，置通風櫥中晾干即可，處理后的玻片可保存半年以上，但要注意污染。2.2實驗方法及步驟2.2.1藍藻毒素的提取取新鮮藻樣用冷凍超速離心機離心4 C, 10000 g離心10 min，得藻漿。取911和910 （1： 1） 的混合藻漿30 g放入燒杯中，加入 500mL體積分數為5%的乙酸溶液，超聲波破碎 30 min , 4 C、 10000 g離心10 min，取得上清1;殘渣用體積分數 80%的甲醇攪拌30 min，同樣條件離心10min , 得上清2;殘渣用體積分數80%的甲醇同樣條件抽提 30 min ,得上清3;合并上清液1、2、3, 70 C, 蒸發

17、近干，用1mL生理鹽水溶解。4 C冷凍保存待用。2.2.2微囊藻毒素的ELISA檢測Beaco n微囊藻毒素檢測試劑盒適用于水中微囊藻毒素的定量檢測。檢測原理Beaco n微囊藻毒素檢測試劑盒由可以和微囊藻毒素及微囊藻毒素酶標記物結合的多克隆抗體 制成。樣品中的微囊藻毒素與微囊藻毒素酶標記物競爭結合數量有限的抗體結點。檢測過程中，先 加入微囊藻毒素酶標記物及含有微囊藻毒素的樣品到測試孔中接著加入抗體，酶標記物與樣品中的 微囊藻毒素競爭結合同樣的抗體的結合點。測試孔中包被有抗兔IgG,用于捕獲加入的兔抗微囊藻毒素抗體。孵育30min后洗掉小孔中所有沒有結合的分子。每孔中加入干凈的底物溶液，連接的

18、酶結合物可以將底物轉化成藍色化合物，一個酶分子可以轉化多個底物分子。由于各個孔中抗體可結合位點是相同的，并且加入的微囊藻毒素酶標記物的量也是相同的，樣 品中微囊藻毒素含量低的則酶標記物結合得多，顏色會顯深藍色。反之，樣品中微囊藻毒素含量高 的則酶標記物結合得少，顏色會顯淺藍色。注意：顏色與微囊藻毒素的含量成反比。較深的顏色=較低的濃度；較淺的顏色 =較高的濃度特異性Beacon微囊藻毒素檢測試劑盒沒有區分微囊藻毒素-LR （作為標準品）及其他類型，然而可以測到微囊藻毒素的其它類型，以下表格中展示的相關值及交叉反應率（%CR）,以下所有濃度均為ppb級。見表2-3表2-3種類%CR微囊藻毒素-L

19、R100微囊藻毒素-RR87微囊藻毒素-YR48Nodularin31試劑盒組成 包被有羊抗兔抗體的的微孔板（12 >8條） 陰性對照品一瓶（0ppb微囊藻毒素-LR） 0.1 ppb, 0.3 ppb, 0.8 ppb, 2 ppb微囊藻毒素-LR標準品各一瓶 1.0ppb微囊藻毒素-LR質量控制液一瓶 微囊藻毒素HRP酶標記物一瓶 兔抗微囊藻毒素抗體溶液一瓶 底物一瓶 停止液一瓶（注意：1N鹽酸，小心處理） 100 X清洗液需要設備酶標儀，薄膜，計時器或表，蒸餾水或去離子水，振蕩器檢測程序1. 將所有試劑及樣品置于室溫下。2. 從鋁箔袋中拿出要求數量的微孔條，放入干燥劑并重新封好袋子

20、以免微孔條受潮。3. 稀釋100倍濃縮清洗液為1倍清洗液，例：取5 mL100倍清洗液到500mL洗瓶中并加入495 ml 蒸餾水。4. 稀釋MCs，用生理鹽稀釋 M（溶液，稀釋20000萬倍。5. 吸取50山酶標記物到微孔板的每個孔中。6. 吸取50山標準，陰性對照，樣品到對應微孔中，各孔依次為陰性對照、0.1 ng/mL標準品、0.3 g/mL標準品、0.8 ng/mL標準品、1.0 ng/mL標準品、2.0 ng/mL標準品和稀釋20000萬樣品。7. 加入50山抗體溶液到每個小孔中。8. 快速震蕩使孔中的溶液混合，并敷上薄膜，或者微孔板可以放在振蕩器上震蕩孵育，從而達 到在孵育期間持續

21、震蕩的效果。9. 孵育 30min。10. 孵育完后，去掉封口膜將微孔中的溶液倒入水槽中，用1倍清洗液清洗完全充滿微孔，震蕩后倒掉，重復四次，總共五次洗板。在吸水紙上拍打，盡可能將水拍干。11. 每個微孔中加入100山 底物溶液。12. 蓋上小孔并孵育30 min。13. 按照加底物的順序每孔中加入100山停止液。停止液為1 N鹽酸，需小心操作。14. 450 nm下讀板，如果酶標儀有雙波長，可同時測605或650 nm雙波長。15. 如果酶標儀可以處理數據，可用曲線擬合，有曲線計算出樣品中的MC濃度，沒有此功能則可用手動計算，計算方法如下： 讀板之后，求標準，陰性對照，樣品的平均吸光度值并按

22、以下方法計算% B0 :% B0=標準，陰性對照，樣品吸光度值的平均值/陰性對照的平均吸光值 以% B。為Y軸，以微囊藻毒素標準濃度的半對數值為X軸，繪制曲線。 通過每個樣品的% B。，在圖上計算出微囊藻毒素的濃度。 如果樣品% B。在設定的標準% B。范圍之內，就可以得出一個具體的濃度值。如果樣品% B。出了范圍只能說明樣品的濃度大于高濃度的標準或低于低濃度的標準。質量控制 1.0 ppb標準品的% Bo值應該處于下面的范圍之內1.0 ppb Microcyst in con trol0.80-1.30 ppb 樣品計算（見表2-4 ）表2-4物質吸光度值平均吸光度+/-SD%RSD%B0濃

23、度（ppb）陰性對照1.4781.515 ±.0523.4100N/A1.5521.2550.11.1941.225 ±.0433.580.8N/A0.9410.30.9320.937 ±.0060.6861.8N/A0.6260.80.6020.614 ±.0172.740.5N/A0.3892.00.3860.302 ±.0080.5425.6N/A樣品0.6100.622 ±.0172.731.50.9090.6342.2.3櫻桃谷蛋的處理將剛孵化的鴨蛋用清水清洗，洗凈表面臟物等。將洗凈的鴨蛋經消毒水（0.1%苯扎溴銨溶液）清洗

24、，然后用紗布一個個擦干。放入孵化框放入孵化箱。（注意檢查鴨蛋外殼是否完好，破損的應即時蠟封或丟棄，防止污染其他鴨胚。）2.2.4鴨胚微囊藻毒素的處理處理方法先將鴨蛋孵化至3天，此時，已經可見卵黃囊血管區，待觀察到胚胎活動時再注射藻毒素。通過體視顯微鏡觀察鴨蛋可見鴨胚卵黃囊血管區，用鉛筆畫圈做標記，標記部位即為注射藻毒素的部位。用針筒吸取已配好的微囊藻毒素溶液，定量對各鴨胚進行注射，注射后用石蠟封口并放 入孵化箱，以防止鴨胚受凍死亡。實驗設計實驗組50枚，每枚注射50 L的微囊藻毒素；對照組 35枚，每枚注射50的生理鹽水。注射器體積為1ml。每天照蛋檢查1次，觀察鴨胚的發育情況，出現死亡，則要

25、即時丟棄，并統計死亡量。孵化至7、9、11天時處死，觀察實驗組和對照組鴨胚的發育情況，分離肝臟，并立即用福爾馬林溶液固定， 進行組織檢測。鴨胚孵化參數 溫度：1-14天胚齡38.5 C。 相對濕度：1-7天胚齡65-70 % , 8 -26天胚齡55 -60%。按照以上標準對孵化箱溫度、濕度以及翻蛋頻率進行調節，使鴨胚在理想條件下進行孵化。225石蠟組織切片的制備固定與包埋1.取材：用鑷子撥開蛋殼空泡面，取出鴨胚，分離肝臟（如圖 2-1可清楚的找到肝臟的分布位置）1.性腺；2.左腎的后部；3.輸卵管分泌部；4.子宮部；5.陰道部；6.泄殖腔；7.心臟;8.左肺；9.肝臟；10.腺胃；11.肌胃

26、；12.小腸；13.盲腸。圖2-1 鴨胚解剖直觀圖2.固定：4 %中性甲醛（10%中性福爾馬林）固定 4-6h。組織大時18-24h或更長。3.水洗:用流水沖洗已經固定的組織塊30min。4.脫水（常溫下）I乙醇一甲醛（AF ）液固定：60mi nn80%乙醇：120mi n出95%乙醇I:120mi nIV95%乙醇II :120mi nV無水乙醇1:60mi n屮無水乙醇II :60mi nVII無水乙醇III :60mi n注意事項：未經充分固定的組織不得進入脫水程序； 用于脫水的試劑容積應為組織塊總體積的5 -10倍以上； 自低濃度乙醇向高濃度乙醇逐級移進脫水； 脫水試劑應及時過濾、更

27、換（500 mL乙醇可用于500個組織塊脫水；加入硫酸銅的無水乙醇變藍時，提示需要更換） 較大組織塊的脫水時間長于較小者，應將兩者分開進行脫水； 組織塊置于無水乙醇內的時間不宜過長（以免硬化）； 丙酮脫水性能強，會使組織塊過縮、硬脆，不宜用以替代無水乙醇。5.透明I二甲苯1:20minn二甲苯II:20min出二甲苯iii :20min注意事項： 二甲苯的容積應為組織塊總體積的5-10倍以上； 組織塊在二甲苯中透明的時間不宜過長（以防組織硬、脆），并依不同種類組織及其大小而異（組織塊呈現棕黃或暗紅色透明即可）； 二甲苯應及時過濾、更換； 組織塊經二甲苯適度處理后不顯透明時，常提示該組織的固定或

28、脫水不充分，應查找原因并妥善處理。6.浸蠟I石蠟1(60 -62 C):60minn石蠟II(60 -62C):60mi n出石蠟iii(60 -62C):60mi n注意事項： 融化石蠟必須有專人負責，必須在熔蠟箱內（65 °）進行，不得用明火加溫； 熔蠟的容積應為組織塊總體積的5-10倍以上； 組織塊經二甲苯適度透明后方可轉入浸蠟過程，應盡可能減少透明后組織塊表面的二甲苯帶入熔蠟中； 浸蠟時間適宜，過短時浸蠟不充分（組織過軟），過長時間組織硬脆； 熔蠟應及時過濾、更換。7.包埋I用加熱的鑷子輕輕夾取已經過浸蠟的組織塊，使組織塊的最大面或被特別指定處的組織面向下包埋。注意事項： 將

29、熔化的石蠟傾入切片盒中，應將組織塊平整地置放于切片盒底面的中央處； 包埋于同一蠟塊內的多塊細小組織應彼此靠近并位于同一平面上； 腔壁、皮膚和黏膜組織必須垂直包埋（立埋）。n待包切片盒內的熔蠟表面凝固后，立即將切片盒移入冷水中加速凝固。川從切片盒中取出凝固的包埋蠟塊（簡稱蠟塊），用刀片去除組織塊周圍的過多石蠟IV用鉛筆對包埋有組織的石蠟進行編號，要求標出組織塊來源，還應清晰可見。V把修整好的蠟塊放入冰箱，以備切片注意事項： 應將組織塊嚴格分件包埋。包埋時一定要首先認真核對組織塊的編號（包括組織塊種類和器官） 必須嚴防各種異物污染，勿將無關組織如縫線、紙屑或其他異物（尤其是硬質異 物）埋入蠟塊內。

30、 包埋過程里要操作迅速，以免組織塊尚未埋妥前熔蠟凝固。8. 切片：調節切片機（一般厚度調至3 um刀片傾斜角5度）,進行切片。切出的蠟片應連續呈帶狀，完整無缺，厚度適宜（3- 5 um）、均勻、無刀痕、顫痕、皺褶、開裂、缺損、松解等。9. 展片：用鑷子輕輕夾取完整、無刀痕、厚度均勻的蠟片，放入伸展器的溫水中（37 C），使切片全面展開（注意：必須水溫適宜、潔凈尤其是水面；每切完一個蠟塊后；必須認真清理水面，不得遺留其他病例的組織碎片，以免污染）。對于展片困難的切片經 30%的乙醇初展后再用載玻片撈起蠟帶放人展片儀水盒內可使切片更易展平。10. 貼片：用經APES處理過的載玻片撈展得好的片子，蠟

31、片與載玻片之間無氣泡。11. 烤片：保持電熱鼓風干燥箱的溫度在60 C,烘烤60 min。蘇木精伊紅（HE）染色1.二甲苯1:5min2.二甲苯II:5min3.無水酒精1:3min4.無水酒精II:3min5. 95% 酒精 1:3min6. 95% 酒精 II :min7. 80%酒精：1min8.蒸餾水：1min9.蘇木素液染色：30min （注意：染色的效果做好在顯微鏡下觀察一下，如果效果不好，再加長時間，時間長了要更換蘇木素液）10.流水洗去蘇木精液：30min （注意：染色的效果做好在顯微鏡下觀察一下，如果效果不好.再加長時間，時間長了要更換0.5%伊紅液）11.稍水洗：2s12.

32、 0.5%伊紅液染色:20mi n13.蒸餾水稍洗：2s14. 80% 酒精：2s15. 95%酒精 I:3min16. 95%酒精 II :3min17. 無水酒精1:5min18. 無水酒精II :5min19. 無水酒精III :5min20. 二甲苯1:5min21. 二甲苯II :5min22. 二甲苯III :5 min23. 中性樹膠封固：干涸前封好（注意：封片要速度快，以免二甲苯揮發完了影響切片的色澤 效果，最好在10S中完成）。2.2.6顯微觀察、采圖將制作好的切片放在熒光倒置顯微鏡下觀察，實驗組與對照組進行比較。2.2.7數據處理通過使用SPSS 13.0統計軟件處理數據。

33、3.結果3.1微囊藻毒素的檢測結果ELISA檢測樣品濃度：檢測結果：tf本遇擇伍=11際豐Sc空自對陰.E t fflttW HC f陽性對坦忙 廠圜控斥粛厲 t? i® S ST試櫻式空防？試廈葉皿遺試日期畫 調皿疲検胭 靈牴頻軍I申 iSteSTKaii-ti-T-b空白楓:|o陰性刃鑿；p亓廠 團性別照-oEEDFF；廠箍號：HSujtjmh抑合曲険曲:|EMpgjcClQO. L473M / Q£ = W.TOID4) = (=D. 83«916)0 畤性:|0.999&3®423Lee5_入庫打印査:5應.臺苣戟心退岀:當苛所有昱示的叩

34、值巳空fi!逛去了空白.ffl*V2|3<寵15TLZST234CL56-81E*Ei0.TI90.帕0.5270. 324一£1£1Er召0.53*0.20.2130.1140.2Q30.0990.111D.0&5D. tilHQ犧1*陶1U言營式：Ekp LojCKi.- f-o IDffTJU) - (-U 03«I5H f 0 CEKEf)ft?摞SR ： |晦臨；便性3 Itt : |瞇310M)0 5E70.1a樹0.3O.£L30.3D.LLL2.0曲域擬合圖3-1 ELISA檢測標準曲線由軟件通過曲線擬合的標準曲線公式為：E

35、xp(Log(0.147304/(x-(-0.78704)-(-0.834916)/0.020366)，相關系數為：0.9998。由公示計算可得微囊藻毒素溶液在不同稀釋倍數下的濃度(見表3-1)表3-1樣品/標準品吸光度濃度ppb藻毒素原始濃度 ®/ml稀釋(1/5)140.4430.18979379374115.8稀釋(1/5)130.4050.23491983419143.3稀釋(1/5)120.3240.36032222853219.9稀釋(1/50)110.2110.64423504185393.2由上表可知， MC平均濃度為：218.05用/ml3.2鴨胚的藻毒素處理結果3

36、.2.1櫻桃谷種鴨蛋的平均重量實驗共購得櫻桃谷種鴨蛋350枚，破18枚，其中未受精的共82枚，受精率為75.30%，隨機抽取受精蛋中的45枚進行稱重(見表3-2)。表3-2櫻桃谷種鴨蛋的平均重量鴨蛋質量(g)72.3971.0881.5773.6165.1977.7475.5671.1175.2367.0379.4682.6365.6466.4570.8173.8375.3772.6673.5870.0877.1773.8776.2673.2781.3787.4878.6769.6863.2866.5264.5665.9367.2573.6467.5072.5278.7981.1875.378

37、4.9876.0771.6968.9767.0366.70本實驗從350枚櫻桃谷種鴨蛋中隨機抽取 45枚進行稱量，鴨蛋的平均重量73.13 ±.87 (SEM )。使 用SPSS 13.0統計軟件使用單一樣本 T檢驗分析可得(見圖3-2),顯著性Sig=0.998>0.05，所以，櫻 桃谷種鴨蛋的個體差異對實驗結果沒有影響，實驗可信度高。T-TestOne-Sample StatisticsNMeanStd. DeviationStd. ErrorMeanweight4573.12825.B1657.8670SOne-Sample TestTest Valuer 73.13td

38、fSig C2-tailed)Mean Difference95% ConfidenceInterval oftlie DifferenceLowerUpperweight-.00244.998-.001 73-1.74931.7457圖3-2 T檢驗分析結果322鴨胚的死亡情況每天照蛋并統計鴨胚的死亡率（見表3-3,圖3-3）表3-4不同孵化天數的死亡率組別不同孵化天數的死亡率4天5天6天7天8天9天10天11天總死亡率實驗組5.56%8.82%12.9%3.70%23.08%00044.44%對照組1.00%2.02%1.03%01.08%2.17%02.22%9.00%鴨胚死亡率率亡死*

39、實驗組-對照組天數圖3-3鴨胚死亡率323鴨胚胎發育過程與解剖特征表3-4鴨胚胎發育的過程與特征鴨蛋孵化天數（天）照蛋時的特征胚蛋解剖時的特征1-1.5蛋黃表面有一顆顏色稍深、四周稍亮 的圓點，俗稱“魚眼珠”或“白光珠”未解剖2.5-3已經可以看見卵黃囊血管區，其形狀 很像櫻桃，故稱“櫻桃珠”未解剖4卵黃囊血管的形狀像靜止的蚊子，俗稱“蚊蟲珠”。卵黃顏色稍深的下部似月牙狀，又稱“月牙”未解剖5蛋轉動時，卵黃不易跟隨轉動，俗稱 “釘殼”。胚胎和卵黃囊血管形狀像一只小的蜘蛛，故又稱“小蜘蛛”未解剖5.5能明顯看到黑色的眼點，俗稱“起 珠”、“單珠”、“起眼”未解剖7胚胎形似“電話筒”，一端是頭部，

40、 另一端為彎曲增大軀干部，俗稱“沉”。正面已布滿擴大的卵黃和血 管正面：胚胎較易看到，像在羊水中浮 游一樣，俗稱“浮”背面：卵黃擴大 到背面，蛋轉動時兩邊卵黃不易晃 動，俗稱“邊口發硬”胚胎已現明顯的鳥類特征，頸伸長，翼、喙明顯，腳上生岀趾，呈水禽結構樣。卵黃增大到最大，蛋白重量相應下降9胚胎的肋骨、肺、肝和胃明顯，四肢成形趾間有蹼。用放大鏡可以看到羽毛原基分布于整個體軀部分10-11蛋轉動時，兩邊卵黃容易晃動，俗稱 “晃得動”。接著背面尿囊血管迅速伸展，越岀卵黃，俗稱“發邊”胚胎眼裂呈橢圓形，腳趾上岀現爪，絨毛原基擴展到頭、 頸部，羽毛突岀明顯，腹腔愈合，軟骨開始骨化。尿囊 迅速向小頭伸展，

41、幾乎包圍整個胚胎。氣室下邊血管顏色特別鮮明，各處血管增加3.3 MC肝組織切片觀察結果3.3.1 MC對肝臟的形態影響把鴨蛋破殼后，取出鴨胚并分離得到新鮮的肝臟，觀察發現對照組鴨胚肝臟有多片肝小葉且清 晰可見；而其他實驗組經藻毒素處理后的鴨胚肝小葉多數處于凝結現象，甚至與腸等部分內臟器官 黏連在一起，只有少數清晰可見。結果顯示，與對照組相比，肝小葉逐漸變小且顏色灰暗，彈性不 強，硬度增大且有充血和腫脹的現象。3.3.2 MC處理的肝臟組織觀察圖3-5對照組第7天肝臟組織切片（400 X）圖3-6實驗組第7天肝臟組織切片（400 X）通過實驗對照圖可以觀察到鴨胚孵化至7天后，對照組鴨胚的肝臟組織

42、清晰，有細胞核等各種細胞器，且排列整齊、規則、胞質豐富，細胞顯得較為飽滿，細胞膜邊界清晰，肝竇狀間隙較小； 而經MC處理后的鴨胚肝臟組織中出現細胞膜邊界模糊，細胞排列不規則等現象。圖3-8實驗組第9天肝臟組織切片（400 X）10urn圖3-7對照組第9天肝臟組織切片（400X）通過實驗對照圖可以觀察到鴨胚孵化至9天后，對照組鴨胚組織清晰， 有細胞核等各種細胞器，且細胞排列整齊、規則、胞質豐富，細胞顯得較為飽滿，細胞膜邊界清晰，肝竇間隙較小；而經MC圖3-9對照組第11天肝臟組織切片（400 X）圖3-10實驗組第11天肝臟組織切片（400 X）處理后的鴨胚肝臟組織中出現細胞膜邊界模糊，肝竇間

43、隙擴大等現象。通過實驗對照圖可以觀察到鴨胚孵化至11天后，對照組鴨胚組織清晰，有細胞核等各種細胞器,且細胞排列整齊、規則、胞質豐富，細胞顯得較為飽滿，細胞膜邊界清晰，肝竇間隙較小；而經MC處理后的鴨胚肝臟組織中出現細胞膜邊界模糊，肝竇間隙擴大等現象。4.討論肝臟是脊椎動物一個很重要的器官，它不僅可以分泌膽汁幫助脂肪消化，且還參加物質代謝， 具有解毒和造血的功能11。MC極易從血液中轉移到肝臟，其進入肝細胞膜可能有兩條途徑：一條 是經過膽酸轉運系統；另一條是通過有機陰離子轉運多肽超家族的成員進行運輸12-14。當MC作用與肝細胞和肝巨噬細胞，就會抑制干細胞中蛋白磷酸酶的活性，高劑量MC可破壞肝細

44、胞骨架，導致肝細胞和竇狀隙發生形態學改變，肝臟廣泛出血，低血溶量休克而造成動物死亡，低劑量主要是 促發肝癌。此外，MC可以在貽貝和扇貝的消化腺內積累，并可以通過食物鏈進入魚、鳥、哺乳動 物和人類15。本實驗通過 MC來處理鴨胚，以研究 MC對鴨胚肝臟的毒性影響，而實驗結果也顯示了MC對鴨胚肝臟組織具有明顯的損害。本實驗所采用的MC是藍藻在特定培養條件下提取的到的，未對其產毒量與產毒效率是否受其他環境因素影響進行探討。本實驗主要運用 ELISA對MC進行定量的檢測。ELISA檢測法是一種固相測定，將抗原包被于聚苯乙烯微孔板后，每孔加入待測抗體孵育。如 待測抗體能與抗原反應，即可產生抗體-抗原結合

45、物。而后加入酶標二抗再經孵育，即生成抗原-抗體-酶標二抗結合物，隨之加底物顯色，用酶標檢測消光值大小，根據標準曲線可算出欲測抗體的濃度，或按抗體的倍比稀釋度計算出效價。本法靈敏度極高，檢測限很低，定量檢測水體總毒素，可達到 p9級水平，且需要樣品量少，前處理簡單。本實驗選擇孵化 3天后的鴨胚，再對其注射藻毒素，是由于三日齡的鴨胚可在鴨蛋中浮動，如 果長時間將打孔過的鴨蛋放置而未對其進行藻毒素的注射，胚胎會浮游到打孔處，此時在對鴨蛋注 射藻毒素可能會破壞鴨胚組織，導致注射后死亡率成倍的上升，而不能確定是否是濃度過高造成的 死亡，對實驗產生誤導，影響實驗結果。此外，三日齡的鴨胚處于開始發育階段，部

46、分器官開始形成，有些已經有雛形，通過毒素處理可以有效的使毒素分布在與鴨胚發育過程中形成的各個器官。同時，也可較為明顯的發現藻毒素對各器官的不同影響情況和器官細胞形態的變化的不同狀況。實驗所采用的石蠟切片技術觀察細胞組織的形態變化。活細胞或組織多為無色透明，各組織間 和細胞內各結構之間均缺乏反差，在一般光鏡下不易清楚區別；然離開機體后就會很快死亡，且發 生組織腐敗，失去原有的正常結構。因此，組織需經固定、石蠟包埋、切片及染色等步驟以免細胞 組織死亡，且又能清晰辨認其形態結構。而本實驗采用的HE染色主要使細胞核內的染色質與胞質內的核糖體著紫藍色，細胞質和細胞外基質著紅色，與石蠟組織切片技術相結合可

47、以很好的觀察組 織或細胞的一般形態及特點16-21。通過石蠟切片與 HE染色觀察發現，經 MC處理后肝細胞呈現組織模糊，細胞排列不規則、胞 質較少、細胞萎縮、細胞膜邊界模糊、肝竇間隙較大，且隨著鴨胚的長大而呈現明顯的增長趨勢。此外，本實驗在鴨胚的發育階段、鴨胚死亡率及分析肝細胞組織變化時均設置了實驗組與對照 組，通過反復比較及統計學軟件的應用確定實驗的最佳方案，從而減少了實驗誤差，確保了實驗結 果的可靠性。5總結與展望肝臟是MC積累和作用的主要靶器官，本實驗主要研究了MC對鴨胚肝臟的毒性影響，但其對其他器官也有一定的積累作用，對于闡明其具體的致毒機理有待進一步的研究。我國是藍藻水華的 多發地帶

48、，對于加強水源藻類毒素污染的防治尤為重要。此外，肝癌的流行病學調查研究結果也證 實了 MC促進腫瘤形成的假說19-21。因此，對于水禽產品及飲用水的安全問題，也必須引起人們的 足夠重視。參考文獻1 Lee T H, Che n Y M, Chou H N. First report of microcyst ins in Taiwan J. Toxico n, 1998,36 :247-255.2 Brittai n S, Mothamed Z A, Wang J. Isolatio n and characterizati on of microcysti ns from a River N

49、ile strain of Oscillatioria ten uis Agardh ex Gomon t J. Toxico n,2000 (38):1759-1771.3 Mez K, Han selma nn K, Preisig H R. Environmen tal con diti ons in high moun ta in lakes containing toxic ben thic cya nobacteria J. Hydrobiologia, 1998 (368):1-15.4 Chu F S, Huang X, Wei R D. Product ion and cha

50、racterizati on of an tibodies aga inst microcyst ins 1989.5 Harada K-I, Mayumi T, Shin ada T, et al. Co-product ion of microcyst ins and aerugi no pepti ns by n atural cyan obacterial bloom. En viro n. Toxicol. , 2001, 16:298-305.6 Bojian S, Gorazd K, Jana B B, et al. The role of microcystins in heavy cyanobacterial bloom formation J. J Pla nkton Pes, 1998,20 (6):691-708.7 Tore L, Petra O, Katrii na K-H, et al. Toxic algae and fish mortality in a brackish-water lake in Ala nd, SWFi nland. Hydrobiologia, 1999, 397: