1、細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.初步掌握凍存與復(fù)蘇的原理及其操作過程2. 繼續(xù)強(qiáng)化細(xì)胞無(wú)菌操作理念細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）二、實(shí)驗(yàn)材料與用品（一）材料：Hela細(xì)胞（二）試劑 培養(yǎng)液：1640培養(yǎng)液+15%小牛血清；胰蛋白酶消化液：0.25%；凍存液、液氮細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）三、實(shí)驗(yàn)原理 細(xì)胞凍存的原理：細(xì)胞凍存的原理：當(dāng)細(xì)胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，細(xì)胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細(xì)胞逐步脫水，細(xì)胞內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會(huì)造成細(xì)胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶

2、。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）低溫保護(hù)劑的應(yīng)用的原理低溫保護(hù)劑的應(yīng)用的原理1、在細(xì)胞凍存時(shí)加入溫保護(hù)劑，能大大提高凍存效率2、常用的低溫保護(hù)劑是DMSO，它是一種滲透性保護(hù)劑，可迅速透入細(xì)胞，提高胞膜對(duì)水的通透性，降低冰點(diǎn)，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞的損傷。10DMSO 20血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液10甘油 20血清基礎(chǔ)培養(yǎng)液細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）當(dāng)細(xì)胞冷到-5至零度時(shí)，可以產(chǎn)生以下變化：細(xì)胞器脫水，在細(xì)胞內(nèi)形成冰晶，對(duì)細(xì)胞器有損傷，復(fù)蘇時(shí)應(yīng)盡快通過該溫度。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）一、細(xì)胞凍存方法一、細(xì)胞凍存方法 1.預(yù)先配制凍存液：

3、含10-30%血清培養(yǎng)基，10% DMSO。 2.取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，胰酶消化后，加全培養(yǎng)基終止消化，1000rpm離心收集細(xì)胞，加入適量?jī)龃嬉? 用吸管吹打制成細(xì)胞懸液（1106 5 106細(xì)胞/ml) 3.加入1ml細(xì)胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細(xì)胞名稱和冷凍日期。 4.冷凍過程要緩慢。4 3060 分鐘-20 30 分鐘 -80 1618 小時(shí)（或過夜）液氮長(zhǎng)期保存四、實(shí)驗(yàn)步驟細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)） DMSO液用培養(yǎng)液配好冰上預(yù)冷，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞。 凍存細(xì)胞必須處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，活力大于90，無(wú)微生物污染

4、。細(xì)胞濃度控制在：1106-5106/ml。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）液氮罐液氮罐細(xì)胞保存條件細(xì)胞保存條件細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）二、細(xì)胞復(fù)蘇方法 1.從液氮中取出冷凍管，迅速投入3738 (或者42 )水浴中，使其融化（1分鐘左右）。 2. 將凍存的細(xì)胞液轉(zhuǎn)移至新10ml離心管中，加入5ml培養(yǎng)液。 3. 低速離心，1000rpm，10分鐘。 4. 去上清，加新鮮培養(yǎng)液3ml。 5. 將剛復(fù)蘇的細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，C02培養(yǎng)箱， 37 培養(yǎng)。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）注意事項(xiàng)注意事項(xiàng)1 1、操作前，提前將操作間和超凈工作臺(tái)內(nèi)紫外燈打開，消毒殺、操作前，提前將操作間和超凈工

5、作臺(tái)內(nèi)紫外燈打開，消毒殺菌菌30 30 分鐘。分鐘。2 2、進(jìn)操作間前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用、進(jìn)操作間前要洗手，進(jìn)入超凈臺(tái)后手要用75%75%酒精或酒精或0.2%0.2%新新潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。潔爾滅擦試。試劑等瓶口也要擦試。3 3、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行。、點(diǎn)燃酒精燈，操作在火焰附近進(jìn)行。4 4、手不能在開蓋的消毒物品上方活動(dòng)。、手不能在開蓋的消毒物品上方活動(dòng)。5 5、吸溶液的吸管等不能混用。、吸溶液的吸管等不能混用。6、凍存復(fù)蘇時(shí)，操作要帶手套，防止凍傷。、凍存復(fù)蘇時(shí)，操作要帶手套，防止凍傷。7、應(yīng)在無(wú)菌條件下操作，注意操作要領(lǐng)，避免污染細(xì)胞。、應(yīng)在無(wú)菌條件下操作，注意操作要領(lǐng)，避免污染細(xì)胞。細(xì)胞的凍存與復(fù)蘇（實(shí)驗(yàn)）謝謝各位認(rèn)真