1、酶抑制法酶抑制法殘留農藥的檢測方法 -酶抑制法生物制藥2 三組酶抑制法酶抑制法.有機磷、氨基甲酸酯類農藥化學性質不穩定，在施用后，容 易受外界條件影響而分解。但有機磷和氨基甲酸酯類農藥中存在著部分高毒和劇 毒品種，如甲胺磷、對硫磷 涕滅威、克百威、水胺硫磷等，如果被施用于生長期較短、連續采收的蔬菜，則很難避免因殘留量超標而導致人畜中毒。 在一定條件下， 有機磷和氨基甲酸酯類藥物對膽堿酯酶正常功能有抑制作用，其抑制率與藥物的濃度相關，正常情況下 ，酶催化神經傳導代謝產物（乙酰膽堿）水解，其水解產物與顯色劑 反應，產生黃色物質，通過抑制率可以判斷出樣品中是否有高劑量有機磷或氨基甲酸酯類藥物的存在。

2、酶抑制法酶抑制法檢測原理利用有機磷和氨基甲酸酯類農藥對動物體內乙酰膽堿酯酶（ AChE ）具有抑制作用的原理，在乙酰膽堿酯酶及其底物（乙酰膽堿）的共存體系中加入農產品樣品提取液（樣品中含有水），如果樣品中不含有機磷或氨基甲酸酯類農藥，酶的活性就不被抑制，乙酰膽堿就會被酶水解，水解產物與加入的顯色劑反應就會產生顏色；反之，如果試樣提取液中含有一定量的有機磷或氨基甲酸酯類農藥，酶的活性就被抑制，試樣中加入的底物就不能被酶水解，從而不顯色。 水解水解加酶加酶顯色劑顯色劑未水解未水解顯色劑顯色劑不顯色不顯色顯色顯色無農藥無農藥有農藥有農藥酶抑制法酶抑制法實驗過程酶抑制法酶抑制法觀察現象 用目測顏色的變

3、化或分光光度計測定吸光度值，計算出抑制率，就可以判斷出樣品中農藥殘留的情況。 AChE 屬于絲氨酸為中心的酶類，羧酸酯酶（非特異性酯酶的一種）與 AChE 類似，同樣以絲氨酸殘基作為活動中心。酶抑制法酶抑制法酶的基質和顯色反應類型 1.酶的基質 酶抑制劑顯色反應可使用的基質（底物）和顯色劑很多。 各種乙酰膽堿（ ACh ）、乙酰萘酯以及其他羧酸酯、乙酸羥基吲哚及其衍生物 考慮：靈敏度，適用性，酶源、基質、顯色劑獲得難易 1. 肉眼觀察法酶片法、試紙法、速測卡法基于反應體系反應前后明顯的顏色變化來觀察、判斷農藥毒性高低的一種定性測量方法。一般選用靛酚乙酸酯（紅色）為底物。 檢測方法酶抑制法酶抑制

4、法酶抑制法酶抑制法原理是： 膽堿酯酶可催化靛酚乙酸酯（紅色）水解為乙酸與靛酚（藍色），有機磷或氨基甲酸酯類農藥對膽堿酯酶有抑制作用，使催化、水解、變色的過程發生改變，由此可判斷出樣品中是否含有有機磷或氨基甲酸酯類農藥。 酶抑制法酶抑制法速測卡以濾紙作載體，白紙片上載有乙酰膽堿酯酶和基質，紅紙片載有顯色劑。 當空白樣品加于白紙片上，在酶作用下，乙酰膽堿與水發生水解，水解產物與顯色劑反應產生顏色。當含有有機磷和氨基甲酸醋類農藥的樣品加于白紙片上時，抑制了乙酰膽堿酯酶的活性，使這種酶不能被水解，從而無顯色反應。酶抑制法酶抑制法實驗現象白色藥片變成藍色，說明農藥殘留無或在檢出限下；白色藥片不變藍，說明

5、含有超出檢出限的農藥。酶抑制法酶抑制法農藥速測卡對幾種常用農藥的最低檢測限（單位mg/kg）如下：甲胺磷 1.7 馬拉硫磷 2.0 水胺硫磷 3.1 對硫磷 1.7 久效磷 2.5 乙酰甲胺磷 3.5 敵敵畏 0.3 樂果 1.3 敵百蟲0.3 呋喃丹 0.5 西維因 2.5 好年冬 1.0 酶抑制法酶抑制法（1）整體測定法選取有代表性的蔬菜樣品，擦去表面泥土，剪成 1cm 左右見方碎片，取 5g放入帶蓋瓶中，加入 10ml 純凈水或 0.1mol /L pH7.5 的磷酸緩沖液 水與菜葉的比例以 ( 1 : l ) ( l :2 ）為宜 ，震搖 50 次，靜置2min 以上。取一片速測卡，用

6、白色藥片蘸取提取液，放置 10min 以上進行預反應，有條件時在 37 恒溫裝置中放置 10min 。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。將速測卡對折，用手捏 3min 或用恒溫裝置恒溫 3min ，使紅色藥片與白色藥片疊合發生反應。每批測定應設一個純凈水或緩沖液的空白對照卡。酶抑制法酶抑制法（2）表面測定法擦去蔬菜表面泥土，滴 2 3 滴洗脫液在蔬菜表面，用另一片蔬菜在滴液處輕輕摩擦。取一片速測卡，將蔬菜上的液滴滴在白色藥片上放置 10min 以上進行預反應，有條件時在 37 恒溫裝置中放置 10min 。預反應后的藥片表面必須保持濕潤。將速測卡對折，用手捏 3min 或用恒溫裝置恒溫 3min

7、 ，使紅色藥片與白色藥片疊合發生反應。每批測定應設一個洗脫液的空白對照卡。- -酶抑制法酶抑制法 試紙法（速測卡法）操作簡單、成本低，但對于深顏色樣品的檢測， 實驗誤差較大，而植物酶片用于植物樣品檢測時也存在基體干擾問題，操作者人為因素較大，靈敏度較低，只能勉強算是一種定性方法。 - -酶抑制法酶抑制法 2.比色法 檢測箱法、酸堿指示劑法、試劑盒法、速測靈法 檢測原理:利用有機磷和氨基甲酸酯類農藥對動物和昆蟲的毒性作用是通過特異性抑制膽堿酯酶（ ChE ）來實現的，但結果的判定是根據比色管溶液的變化通過目測比色來完成的。 加入20ml提取試劑提 取 取1g樣品（非葉菜類取4g），切碎取 樣振蕩12min抑制反應將上清液倒入試管中，靜止3min，加入50ul酶，3ml樣品提取液，50ul顯色劑培 養倒入比色杯測定儀器測定酶抑制法酶抑制法酶抑制法酶抑制法酶源種類與酶液制備 1 酶源的種類 酶源選擇是生物酶技術應用的基礎，其性質的好壞、特異性大小、穩定與否直接關系到檢測的結果。 各種農藥對一些酶的活性均有不同程度的抑制作用。酶抑制法酶抑制法 常用的酯酶： 動物（牛、豬、綿羊、猴、鼠、兔或雞）的肝臟酯酶； 人血漿或血清； 馬血清或黃鱔血中的膽堿酯酶； 蜜蜂或蠅頭的腦酯酶； 動物（兔、牛、鼠）的羧酸酯酶。 肝酯酶和植物酯酶應用較少，常用的