1、第六章第六章 凝膠層析凝膠層析凝膠層析的基本原理凝膠層析的基本原理凝膠介質的基本性質凝膠介質的基本性質凝膠層析的基本操作凝膠層析的基本操作凝膠介質的選用原則凝膠介質的選用原則分子篩色譜（凝膠過濾）分子篩色譜（凝膠過濾） 層析法所用的凝膠顆粒大小要均一，顆粒內外貫穿許多小孔徑的通路，分子量小的物質，比較容易進入顆粒中，因此被延滯流出。親水性高，表面惰性，即介質與溶質之間不親水性高，表面惰性，即介質與溶質之間不發生任何化學或物理相互作用；發生任何化學或物理相互作用；穩定性強，在較寬的穩定性強，在較寬的ph和離子強度范圍以及和離子強度范圍以及化學試劑中保持穩定，使用壽命長，化學試劑中保持穩定，使用壽

2、命長，具有一定的孔徑分布范圍；具有一定的孔徑分布范圍；機械強度高，允許較高的操作壓力（流速）。機械強度高，允許較高的操作壓力（流速）。 l凝膠特性參數l內水體積內水體積vi：孔體積孔體積l外水體積外水體積vo：顆粒間體積顆粒間體積l柱床體積柱床體積vt vt=vo+vi+ vg vt= vi+vol洗脫體積洗脫體積ve ve=vo+kdvi lkd=(ve-vo)/via：“全排阻全排阻”， 流經體積流經體積vo kd=0c：“全滲入全滲入”， 流經體積流經體積vo+vi kd=1b：“部分排阻部分排阻”或或 ve=vo+kdvi 0 kd1kd=(ve-vo)/vi “排阻系數排阻系數” 或

3、或“分配系數分配系數”一定規格凝膠，一定規格凝膠， kd特征常數特征常數kd1 物質分子與凝膠之間有吸附物質分子與凝膠之間有吸附 tyr=1.4 g-25小分子小分子kd1 水合作用水合作用 nacl 0.8 g 0.9整個凝膠作為固定相整個凝膠作為固定相 vi+vgkav=(ve-vo)/(vt-vo)=kdvi/(vt-vo) 有效分配系數有效分配系數分子形狀不同分子形狀不同m相近也可分開相近也可分開牛血清白蛋白（球）、兔血紅蛋白（棍）牛血清白蛋白（球）、兔血紅蛋白（棍） 68000d排阻極限（排阻極限（exclusion limit）l是指不能擴散到凝膠網絡內部的最小分子的是指不能擴散到

4、凝膠網絡內部的最小分子的相對分子質量。例如相對分子質量。例如sephadex g50的排阻極的排阻極限是限是30 kd。分級范圍（分級范圍（fractionation range）l能被凝膠阻滯并且能被凝膠阻滯并且相互之間可以得到分離相互之間可以得到分離的的溶質的相對分子質量范圍。溶質的相對分子質量范圍。sephadex g50的的分級范圍為分級范圍為1.530 kd。 凝膠粒徑凝膠粒徑l凝膠一般為球形，其粒徑大小對分離度有重要凝膠一般為球形，其粒徑大小對分離度有重要影響。影響。粒徑越小，分離效率越高。粒徑越小，分離效率越高。凝膠粒徑多凝膠粒徑多用篩目或微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為用篩目或

5、微米表示。軟凝膠粒徑較大，一般為50150 m（100200目），例如，目），例如，sepharose和和sephadex凝膠粒徑分布為凝膠粒徑分布為45165 m 。l硬凝膠粒徑較小，一般為硬凝膠粒徑較小，一般為550 m 。床體積（床體積（bed volume）l即即1 g干燥凝膠溶脹后所占有的體積。干燥凝膠溶脹后所占有的體積。sephadex g50的床體積為的床體積為911 cm3/g干膠。干膠。空隙體積（空隙體積（void volume）l即即v0值。空隙體積可用相對分子質量大于排阻值。空隙體積可用相對分子質量大于排阻極限的溶質測定，一般使用平均相對分子質量極限的溶質測定，一般使用平

6、均相對分子質量為為2000 kd的水溶性藍色葡聚糖的水溶性藍色葡聚糖（blue dextran）。）。l對于商品化的凝膠過濾介質，廠商的產品目錄對于商品化的凝膠過濾介質，廠商的產品目錄中一般均給出其凝膠的各種性質，如分級范圍、中一般均給出其凝膠的各種性質，如分級范圍、粒徑、流速與壓力的關系等，可參考使用。粒徑、流速與壓力的關系等，可參考使用。溶質與介質不發生任何形式的相互作用，因此溶質與介質不發生任何形式的相互作用，因此可采用可采用恒定洗脫恒定洗脫法洗脫展開，操作法洗脫展開，操作條件溫和條件溫和，產品收率可接近產品收率可接近100；每批分離操作結束后每批分離操作結束后不需要不需要進行介質的進行

7、介質的再生再生，故容易實施循環操作，提高產品純度；故容易實施循環操作，提高產品純度；作為脫鹽手段，作為脫鹽手段，gfc比透析法速度快，精度比透析法速度快，精度高；與超濾法相比，剪切應力小，蛋白質活性高；與超濾法相比，剪切應力小，蛋白質活性收率高；收率高；分離機理簡單，操作參數少，容易規模放大。分離機理簡單，操作參數少，容易規模放大。僅根據溶質之間分子量的差別進行分離，分僅根據溶質之間分子量的差別進行分離，分離較慢、需嚴格離較慢、需嚴格控制流速控制流速；經經gfc洗脫展開后產品被稀釋。因此需要在洗脫展開后產品被稀釋。因此需要在具有濃縮作用的單元操作（如超濾、離子交具有濃縮作用的單元操作（如超濾、

8、離子交換和親和色譜等）后使用。換和親和色譜等）后使用。l葡聚糖系葡聚糖系l其中其中sephadex g是最傳統的軟凝膠過濾介質是最傳統的軟凝膠過濾介質之一，目前仍被廣泛使用。之一，目前仍被廣泛使用。sephadex g是利是利用葡聚糖（右旋糖酐）交聯制備的，交聯劑用葡聚糖（右旋糖酐）交聯制備的，交聯劑一般采用環氧氯丙烷一般采用環氧氯丙烷。sephadex凝膠按交聯凝膠按交聯度大小，分度大小，分g 10g 200共八種型號。共八種型號。g-10g-15g-25g-50g-75g-100g-150g-200吸水量吸水量（g/g干凝膠）干凝膠）1.01.52.55.07.510.015.020.0工

9、作范工作范圍（肽圍（肽與蛋白）與蛋白）d700150050001500-200003000-700004000-1500005000-3000005000-500000 性質性質1.對稀酸、稀堿、鹽溶液穩定對稀酸、稀堿、鹽溶液穩定2.2.濕態的葡聚糖可加熱到濕態的葡聚糖可加熱到110，干的則能耐受，干的則能耐受120高溫高溫3. 交聯度交聯度穩定性穩定性4. 凝膠含少量羧基，對陽離子輕微吸附，操作時使凝膠含少量羧基，對陽離子輕微吸附，操作時使i0.02mol/l5. 芳香族、雜環化合物有時芳香族、雜環化合物有時kd1 6. 新凝膠柱非特異性吸附蛋白，先用廉價較惰性蛋新凝膠柱非特異性吸附蛋白，先

10、用廉價較惰性蛋白飽和吸附、洗滌白飽和吸附、洗滌l規格編號規格編號 間接反映凝膠孔徑、滲入限、排阻限間接反映凝膠孔徑、滲入限、排阻限 g-50 分離限分離限1500-30000 g-150：5000-400000 對蛋白、多糖分離范圍不同對蛋白、多糖分離范圍不同 （多糖分子體積比相同（多糖分子體積比相同m的蛋白大）的蛋白大） 粒度：直徑粒度：直徑100-300um粗粒粗粒 20-80um細粒細粒 40-120um中粒中粒l保存保存 濕法：懸浮于水、緩沖液中，濕法：懸浮于水、緩沖液中，0.02%nan3，0-5 干法：乙醇分步處理（干法：乙醇分步處理（20%，40%，60%，80%） 脫水收縮，抽

11、濾，脫水收縮，抽濾，60-80 吹干，室溫吹干，室溫 半縮法：半縮法：60-70%乙醇懸液，封口，乙醇懸液，封口，4 修飾葡聚糖凝膠修飾葡聚糖凝膠l親脂性親脂性 引入有機基團引入有機基團 sephadex lh-20（羥丙基）（原羥丙基）（原sephadex g-25） 流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機溶劑流動相既可使用緩沖水溶液，也可使用極性有機溶劑氯仿、四氯仿、四氫呋喃氫呋喃，因此因此適用于非水溶性溶質的凝膠過濾適用于非水溶性溶質的凝膠過濾 交聯葡聚糖離子交換劑交聯葡聚糖離子交換劑 引入引入cm-，deae-，離子交換、離子交換、 分子篩分子篩 人工合成凝膠，控制凝膠總濃度和交聯

12、劑的用量可制成各種型號的凝膠，交聯劑越多，孔隙越小。商品名為bio-gel，型號從p-2至p-300共10種（ 數字x1000就相當于該凝膠的排阻限度） 特點：化學穩定性好ph2-11， 無非特異性吸附， 不為微生物利用粒度：粗150-300um 中75-150um 細40-75um 極細40um聚丙烯酰胺凝膠 是由是由海藻多糖海藻多糖瓊脂中分離出來的天然凝膠，瓊脂中分離出來的天然凝膠， 常見的有常見的有sepharose （ sepharose 2b、4b、6b，數字代表數字代表 干膠的百分比干膠的百分比 ） bio-gel-a（美國）美國）等等 （bio-gel-a 0.5m、1.5m、5

13、m、15m、50m、150m， 數字數字x106代表排代表排阻限度。阻限度。骨架各線性分子間以氫鍵相連，骨架各線性分子間以氫鍵相連，孔徑依賴于濃度孔徑依賴于濃度瓊脂糖凝膠 特點特點： 1.化學穩定性差，化學穩定性差，ph4-9 2.脫水、干燥、冷凍、有機溶劑、脫水、干燥、冷凍、有機溶劑、溫度高于溫度高于40便融化便融化 3.與硼酸形成配合物，孔徑變化，避免與硼酸形成配合物，孔徑變化，避免 4.強度低強度低，隨凝膠濃度，隨凝膠濃度而而，彈性小，調整柱壓，彈性小，調整柱壓 5.非特異性吸附力葡聚糖，非特異性吸附力葡聚糖，i0.01mol/l無明顯吸附無明顯吸附 6.分離的分離的m范圍大范圍大（10

14、8），隨凝膠濃度），隨凝膠濃度而而 l架橋瓊脂糖凝膠架橋瓊脂糖凝膠 sepharose cl 1，3-二溴丙醇二溴丙醇交聯交聯，孔徑均勻，孔徑均勻，孔徑大小和分離范圍孔徑大小和分離范圍與普通與普通瓊脂糖瓊脂糖一樣，但一樣，但機械強度機械強度，熱穩定性，熱穩定性，化學，化學穩定性穩定性（ph3-14） l超膠（超膠（ultro-gel aca) 瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠瓊脂糖與聚丙烯酰胺的混合凝膠 比比sepharose 化學穩定性好，強度高，化學穩定性好，強度高，ph3-10，熱穩定性不變熱穩定性不變 aca 34：丙烯酰胺丙烯酰胺3%，瓊脂糖，瓊脂糖4% 分離范圍：生物膠分離范圍：生物膠

15、p超膠瓊脂糖超膠瓊脂糖 bio-glas 500 孔徑孔徑500 將多孔硅酸鹽玻璃加工制得，粉末狀，可粘合將多孔硅酸鹽玻璃加工制得，粉末狀，可粘合 特點特點：化學穩定性高，強度大，耐高壓，：化學穩定性高，強度大，耐高壓， 對糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡鈍對糖、蛋白有吸附，用聚乙烯二醇浸泡鈍化化實驗操作實驗操作凝膠介質的選擇凝膠介質的選擇 將樣品中的大分子物質與小分子物質分開，其分離策略是使高分子物質完全被排阻，小分子物質完全滲入凝膠內。類分離一般選用sephadex g-25蛋白脫鹽（分子量范圍1000-5000）或選用g-50。對于小肽和低分子量的物質的脫鹽可選用sephadex g-1

16、0、g-15（分子量范圍 -1500）、bio-gel p-2或p-4類分離凝膠介質的選擇凝膠介質的選擇將樣品中一些分子量比較接近的物質分開，該策略是使m盡量在分離范圍的兩側 3個組分： kd 0 0.5 1在層析過程中，樣品中各組份均能不同程度地深入到凝膠內部，但由于深入凝膠空隙程度上的差異，最后得到分離。分離血清蛋白可用g200 5000-800000 強度低 或g150 5000-400000分級分離l粒度的選擇粒度的選擇 細粒：流速低，洗脫峰窄，分辨率高，精制或分析細粒：流速低，洗脫峰窄，分辨率高，精制或分析 粗粒：粗粒： 用于粗制、脫鹽用于粗制、脫鹽 將干膠顆粒懸浮于將干膠顆粒懸浮于

17、10倍以上吸液量的蒸餾水或倍以上吸液量的蒸餾水或洗脫液中充分溶脹。加熱可使溶脹加速，即在洗脫液中充分溶脹。加熱可使溶脹加速，即在沸水浴沸水浴5小時即可達到凝膠的充分溶脹。小時即可達到凝膠的充分溶脹。 加熱法既可節省時間又可加熱法既可節省時間又可排氣排氣、消毒。、消毒。 商品懸浮液去除保存液、抽濾、洗滌、平衡商品懸浮液去除保存液、抽濾、洗滌、平衡 不需溶脹不需溶脹l層析柱的選擇層析柱的選擇 柱比：長度柱比：長度/直徑、直徑、 體積體積 類分離：類分離： 柱床體積為樣品體積柱床體積為樣品體積5倍倍或略多或略多 柱比柱比5:1-10:1 分級分離：分級分離：25-100倍倍 柱比柱比25-100 大

18、柱、長柱流速慢、稀釋嚴重、分辨率高大柱、長柱流速慢、稀釋嚴重、分辨率高 實驗室用的層析柱工業用的層析柱 裝柱裝柱 1.1.裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，裝柱前，必須用真空干燥器抽盡凝膠中空氣，并將凝膠上面過多的溶液傾出。并將凝膠上面過多的溶液傾出。 2.2.先關閉層析柱出水口，向柱管內加入約先關閉層析柱出水口，向柱管內加入約1/3柱容積的洗脫液，將凝膠液連續傾入柱中，使柱容積的洗脫液，將凝膠液連續傾入柱中，使其自然沉降，等凝膠沉降約其自然沉降，等凝膠沉降約2-3cm后，打開柱后，打開柱的出口，使凝膠繼續沉集，裝柱完畢，關閉出的出口，使凝膠繼續沉集，裝柱完畢，關閉出水口。水口。 不能出

19、現分層、傾斜、氣泡不能出現分層、傾斜、氣泡 通過通過2-3倍柱床容積的洗脫液使柱床穩定，倍柱床容積的洗脫液使柱床穩定，然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾然后在凝膠表面上放一片濾紙或尼龍濾布，布，以防加樣時凝膠被沖起以防加樣時凝膠被沖起，并始終保，并始終保持凝膠上端有一段液體。持凝膠上端有一段液體。 上柱樣品溶液的體積根據分離要求來確定：進樣體積進行組別分離時，樣品溶液最大可為柱體積的10%進行分級分離時，樣品溶液的體積要小，這樣洗脫出的峰形好，蛋白類濃度蛋白類濃度4%l洗脫洗脫 用水、緩沖液、水用水、緩沖液、水-甲醇、水甲醇、水-丙酮、氨水、醋酸丙酮、氨水、醋酸 溫度、流速、柱壓、阻力恒定溫度

20、、流速、柱壓、阻力恒定 防止非特異性吸附防止非特異性吸附 操作壓操作壓流速快，峰寬流速快，峰寬 相當大柱壓范圍內相當大柱壓范圍內 v=kp/l 相同操作壓，編號小，交聯度大，顆粒粗，流速大相同操作壓，編號小，交聯度大，顆粒粗，流速大 部分收集器部分收集器返回自動餾分收集儀（進口）l再生再生 重復使用重復使用 流速下降、板結可反沖，取出漂洗流速下降、板結可反沖，取出漂洗l凝膠床的檢查和維護凝膠床的檢查和維護使用時間過長、流速過大、柱高過大，流速使用時間過長、流速過大、柱高過大，流速 控制操作壓：柱進出口液位差控制操作壓：柱進出口液位差凝膠的保存：凝膠的保存：0.02%疊氮鈉或疊氮鈉或0.002%

21、洗必泰洗必泰返回蠕動泵返回返回國產柱層析系統伯樂公司（bio-rad）柱層析系統注意事項注意事項1）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損。）各接頭不能漏氣，連接用的小乳膠管不要有破損。2）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的）裝柱要均勻，既不過松，也不過緊，最好在要求的操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免壓緊凝膠。操作壓下裝柱，流速不宜過快，避免壓緊凝膠。3）始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則凝膠混入大）始終保持柱內液面高于凝膠表面，否則凝膠混入大量氣泡，影響液體在柱內的流動。量氣泡，影響液體在柱內的流動。l生物大分子溶液的脫鹽生物大分子溶液的脫鹽 用用 大粒度、高交聯度凝膠大粒度、

22、高交聯度凝膠 使蛋白使蛋白kd=0，鹽類鹽類kd=1 蛋白脫鹽后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀鹽蛋白脫鹽后溶解度降低，吸附或沉淀，用稀鹽（易揮發鹽）洗脫，真空干燥（易揮發鹽）洗脫，真空干燥 樣品體積樣品體積vi/3 l去熱原去熱原 sephadex g-25 氨基酸氨基酸 kd=1 熱原熱原kd=0 樣品體積樣品體積 30%vtlgfc可用于相對分子質量從幾百到可用于相對分子質量從幾百到106 數量級的物質的分離純化。數量級的物質的分離純化。 g-50除去結晶胰島素中前胰島素、大分子抗原除去結晶胰島素中前胰島素、大分子抗原 g-25除去青霉素中抗原性雜質、致敏、高分子除去青霉素中抗原性雜質、致敏、高分子雜質雜質 l右圖是一例利右圖是一例利 用高效用高效gfc分離骨髓分離骨髓 血清蛋白質的結果。血清蛋白質的結果。 色譜柱： 10300，superose 6洗脫液：0.05moll磷酸鹽0.15moll nacl（ph7.0）流量：0.2mlmin1.iga高聚體 2. iga二聚體 3.iga單體 4.igg 5.白蛋白l在凝膠過濾介質的分級范圍內在凝膠過濾介質的分級范圍內蛋白質的分配蛋白質的分配系數（或洗脫體積）與相對分子質量的對數系數（或洗脫體積）與相對分子質量的對數成正比成正比，所以，所以gfc可用于未知物質相對分子可用于未知物質相對分子質量的測定。質