1、蛋白質的共價結構系統蛋白質蛋白質 （ProteinProtein）1838年，年，J. J. Berzelius提出，由提出，由proteios衍生而來衍生而來 第一重要，首要的物質第一重要，首要的物質蛋白質的共價結構系統蛋白質存在于蛋白質存在于所有所有生物細胞中，是生物細胞中，是構成生物體最基本的結構物質和功構成生物體最基本的結構物質和功能物質。能物質。蛋白質是生命活動的物質基礎，參蛋白質是生命活動的物質基礎，參與了幾乎所有的生命活動過程。與了幾乎所有的生命活動過程。蛋白質的共價結構系統一、蛋白質通論一、蛋白質通論蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統、蛋白質的含氮量、蛋白質的含氮量v蛋白

2、氮占生物組織所有含氮物質的絕大部分。蛋白氮占生物組織所有含氮物質的絕大部分。v大多數蛋白質含氮量接近于大多數蛋白質含氮量接近于16%16% 蛋白質含量蛋白質含量 = = 每克樣品中含氮的克數每克樣品中含氮的克數 6.256.25v凱氏定氮法凱氏定氮法蛋白質的共價結構系統、蛋白質的分類、蛋白質的分類（1 1）、依據外形分類）、依據外形分類 球狀蛋白質：球狀蛋白質：globular protein 纖維狀蛋白質纖維狀蛋白質：fibrous protein 膜蛋白質膜蛋白質：membrane protein 蛋白質的共價結構系統（2 2）、依據蛋白質的組成分類）、依據蛋白質的組成分類 簡單蛋白簡單蛋

3、白 simple protein 單純蛋白，僅由氨基酸組成單純蛋白，僅由氨基酸組成 結合蛋白結合蛋白 conjugated protein由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成由簡單蛋白與其它非蛋白成分結合而成蛋白質的共價結構系統簡簡單單蛋蛋白白 清蛋白和球蛋白清蛋白和球蛋白 albumin and globulin 廣泛存在于動物組織廣泛存在于動物組織 谷蛋白和醇溶谷蛋白谷蛋白和醇溶谷蛋白 glutelin and prolamin 植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸/ /堿堿 精蛋白和組蛋白精蛋白和組蛋白 堿性蛋白存在于細胞核堿性蛋白存在于細胞核 硬蛋白硬蛋白 蛋白質

4、的共價結構系統結結合合蛋蛋白白 色蛋白：色蛋白：簡單蛋白簡單蛋白+ +色素物質色素物質 糖蛋白：糖蛋白：簡單蛋白簡單蛋白+ +糖類物質糖類物質 脂蛋白：脂蛋白：簡單蛋白簡單蛋白+ +脂類結合脂類結合 核蛋白核蛋白：簡單蛋白：簡單蛋白+ +核酸核酸蛋白質的共價結構系統（二）、蛋白質的大小與分子量（二）、蛋白質的大小與分子量 蛋白質是分子量很大的生物分子蛋白質是分子量很大的生物分子 對任一種給定的蛋白質，其所有分子在對任一種給定的蛋白質，其所有分子在AAAA組成和順序以及肽鏈的長度方面都應組成和順序以及肽鏈的長度方面都應是相同的，即所謂均一的蛋白質。是相同的，即所謂均一的蛋白質。蛋白質的共價結構系

5、統蛋白質的共價結構系統l蛋白質與多肽無嚴格的界線蛋白質與多肽無嚴格的界線 通常將通常將6000Dr6000Dr以上的多肽稱為蛋白質。以上的多肽稱為蛋白質。l蛋白質分子量變化范圍很大蛋白質分子量變化范圍很大蛋白質蛋白質月示月示胨胨多肽多肽肽肽AAAA 1*104 5*103 2*103 1000 200 100 -500蛋白質的共價結構系統（三）蛋白質構象和結構的組織層次（三）蛋白質構象和結構的組織層次蛋蛋白白質質的的結結構構層層次次一級結構一級結構二級結構二級結構超二級結構超二級結構結構域結構域三級結構三級結構四級結構四級結構高級結構高級結構空間構象空間構象蛋白質的共價結構系統示示例例蛋白質的

6、共價結構系統蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統（四）、蛋白質功能的多樣性（四）、蛋白質功能的多樣性 1. 1. 催化功能催化功能- -酶酶 2. 2. 調節功能調節功能- -激素、基因調控因子激素、基因調控因子 3. 3. 轉運功能轉運功能- -膜轉運蛋白、血紅膜轉運蛋白、血紅/ /血清蛋白血清蛋白 4. 4. 貯存功能貯存功能- -乳、蛋、谷蛋白乳、蛋、谷蛋白 5. 5. 運動功能運動功能- -鞭毛、肌肉蛋白鞭毛、肌肉蛋白 6. 6. 結構成分結構成分- -皮、毛、骨、牙、細胞骨架皮、毛、骨、牙、細胞骨架 7. 7. 支架作用支架作用- -接頭蛋白接頭蛋白 8. 8

7、. 防御功能防御功能- -免疫球蛋白免疫球蛋白 9. 9. 異常功能異常功能蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統AA-NHAA-NH2 2與另一與另一AA-COOHAA-COOH間失水形成的酰胺鍵間失水形成的酰胺鍵稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。稱肽鍵，所形成的化合物稱肽。蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統l由兩個由兩個AAAA組成的肽稱為二肽。組成的肽稱為二肽。l由多個由多個AAAA組成的肽則稱為多肽。組成的肽則稱為多肽。l組成多肽的組成多肽的AAAA單元稱為氨基酸殘基。單元稱為氨基酸殘基。蛋白質的共價結構系統CCNCCNCCNCCNCCH2CHCH2CH2CH2COO-OHCO2HC

8、H2CONH2OHCH3H3N+OOOOHHHHHHHHHSerValTyrAspGlnCH3N-端C-端肽鍵 多肽鏈中多肽鏈中AAAA殘基按一定順序排列：氨基酸順序殘基按一定順序排列：氨基酸順序 含游離含游離 - -氨基的一端：氨基端或氨基的一端：氨基端或N-N-端端 含游離含游離 - -羧基的一端：羧基端或羧基的一端：羧基端或C-C-端端 AAAA順序是從順序是從N-N-端開始以端開始以C-C-端氨基酸殘基為終點端氨基酸殘基為終點 如上述五肽：如上述五肽：Ser-Val-Tyr-Asp-GlnSer-Val-Tyr-Asp-Gln蛋白質的共價結構系統（一）、肽和肽鍵的結構（一）、肽和肽鍵的

9、結構蛋白質的共價結構系統肽鍵中肽鍵中C-NC-N鍵有部分鍵有部分 雙鍵性質雙鍵性質 不能自由旋轉不能自由旋轉組成肽鍵原子處于組成肽鍵原子處于 同一平面（肽平面）同一平面（肽平面）鍵長及鍵角一定鍵長及鍵角一定大多數情況以反式大多數情況以反式 結構存在結構存在蛋白質的共價結構系統共價主鏈共價主鏈 蛋白質的共價結構系統肽末端肽末端-羧基羧基pKa值比游離值比游離AA中的大。中的大。 肽末端肽末端-氨基氨基pKa值比游離值比游離AA中的小。中的小。 等電點（兩性）。等電點（兩性）。 酸堿性質取決于：酸堿性質取決于： -羧基、羧基、-氨基、側鏈基團的解離氨基、側鏈基團的解離 具有雙縮脲反應具有雙縮脲反應

10、Pr特有的反應。特有的反應。蛋白質的共價結構系統（三）、（三）、 天然存在的重要多肽天然存在的重要多肽蛋白質的共價結構系統NHCOCH2NHCOCHNHCOCH3CHCHOHCH2OHCHHNCNHCHCNHCH2CCOCHNHHOCH2NHNHCHCHCH3CH2CH3COOOOCH2CH2SOOH鵝膏覃堿的化學結構蛋白質的共價結構系統CysTyrILeGlnAsnCysProLeuGlyNH2SS牛催產素CysTyrGlnAsnCysProSSPheArgGlyNH2牛加壓素蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統三、蛋白質一級結構的測定三、蛋白質一級結構的測定什么是什么是PrPr的一級結

11、構？的一級結構？蛋白質中氨基酸的排列順序。蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統 1.1.樣品必需純（樣品必需純（97%97%以上）以上） 2.2.知道蛋白質的分子量知道蛋白質的分子量 3.3.知道蛋白質由幾個亞基組成知道蛋白質由幾個亞基組成 4.4.測定蛋白質的測定蛋白質的AAAA組成并根據分子量組成并根據分子量 計算每種計算每種AAAA的個數的個數 5.5.測定水解液中的氨量計算酰胺的含量測定水解液中的氨量計算酰胺的含量前提前提蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(1) 測定蛋白質分子中多肽鏈的數目測定蛋白質分子中多肽鏈的數目 通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與

12、蛋通過測定末端氨基酸殘基的摩爾數與蛋白質分子量之間的關系，即可確定多肽白質分子量之間的關系，即可確定多肽鏈的數目。鏈的數目。蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(2)(2) 多肽鏈的拆分多肽鏈的拆分蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略 幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，幾條多肽鏈借助非共價鍵連接在一起，稱為寡聚蛋白質，血紅蛋白為四聚體，稱為寡聚蛋白質，血紅蛋白為四聚體，烯醇化酶為二聚體。烯醇化酶為二聚體。 可用可用8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍處理，鹽酸胍處理，即可分開多肽鏈即可分開多肽鏈( (亞基亞基

13、) )。蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(3)(3) 斷開二硫鍵斷開二硫鍵 在在8mol/L8mol/L尿素或尿素或6mol/L6mol/L鹽酸胍存在下，鹽酸胍存在下，用過量的用過量的 - -巰基乙醇處理，使二硫鍵還巰基乙醇處理，使二硫鍵還原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成原為巰基，然后用烷基化試劑保護生成的巰基，防止重新被氧化。的巰基，防止重新被氧化。蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(4)(4)測定每條多肽鏈的測定每條多肽鏈的AAAA組成，并計算組成，并計算出出AAAA成分的分子比成分的分子比 蛋白質的共價結

14、構系統蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(5)(5)分析多肽鏈的分析多肽鏈的N-N-末端和末端和C-C-末端末端(6)(6)多肽鏈斷裂成多個肽段多肽鏈斷裂成多個肽段 采用兩采用兩/ /多種不同的斷裂方法將多肽多種不同的斷裂方法將多肽 斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。斷裂成兩套或多套肽段，并將其分離。蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(7)(7)測定每個肽段的氨基酸順序測定每個肽段的氨基酸順序(8)(8)確定肽段在多肽鏈中的次序確定肽段在多肽鏈中的次序 利用兩利用兩/ /多套肽段的多套肽段的AAAA順序彼此間的順序彼此間的交錯重疊，拼

15、湊出整條多肽鏈的交錯重疊，拼湊出整條多肽鏈的AAAA順序。順序。蛋白質的共價結構系統（一）、蛋白質測序策略（一）、蛋白質測序策略(9)(9)確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。確定原多肽鏈中二硫鍵的位置。蛋白質的共價結構系統 兩類多肽鏈末端氨基酸殘基：兩類多肽鏈末端氨基酸殘基： N- N-端氨基酸端氨基酸 C- C-端氨基酸端氨基酸 在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是在肽鏈氨基酸順序分析中，最重要的是N-N-端氨基酸分析法。端氨基酸分析法。（二）、末端氨基酸殘基測定（二）、末端氨基酸殘基測定蛋白質的共價結構系統 Sanger法法 二硝基氟苯（二硝基氟苯（DNFBDNFB）法）法O2NFNO2+ H2N

16、CHCROHNCHCROO2NNO2H+H2OO2NNO2HNCHCROOH+氨基酸氨基酸DNFBN-端氨基酸端氨基酸DNP衍生物衍生物DNP-氨基酸氨基酸（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定N堿性條件堿性條件二硝基苯衍生物二硝基苯衍生物黃色黃色蛋白質的共價結構系統 二甲氨基萘磺酰二甲氨基萘磺酰-AA-AA有強熒光，檢測靈敏度高有強熒光，檢測靈敏度高 丹磺酰氯（丹磺酰氯（DNSDNS）法）法N(CH3)2SO2ClH2NCHCROHNCHCROSO2N(CH3)2+水解N(CH3)2SO2HNCHCROOH+氨基酸丹磺酰氯多肽N-端丹磺酰N-端氨基酸丹磺酰氨基酸（二）、末端

17、氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定1N(DNS-aa)蛋白質的共價結構系統苯異硫氰酸酯（苯異硫氰酸酯（PITC)PITC)法法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定1N蛋白質的共價結構系統N=C=S + NCHCOOHHHRPITCNCNCHCOOHHHRSPTC-氨基酸NCHRSNCCOPTH-氨基酸pH8.3無水HF苯異硫氰酸酯苯異硫氰酸酯PITC蛋白質的共價結構系統 肽鏈外切酶肽鏈外切酶: :從多肽鏈從多肽鏈N-N-端逐個向里水解端逐個向里水解 根據不同反應時間測出釋放的根據不同反應時間測出釋放的AAAA種類和數量，種類和數量， 按反應時間和按反應時間和AAA

18、A殘基釋放量作動力學曲線殘基釋放量作動力學曲線 蛋白質蛋白質N-N-末端殘基順序。末端殘基順序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶 水解以水解以LeuLeu殘基為殘基為N-N-末端的肽鍵速度最大。末端的肽鍵速度最大。氨肽酶法氨肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定1N蛋白質的共價結構系統 肼化物可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質肼化物可與苯甲醛縮合成不溶于水的物質 肼解法肼解法H2NCHCROHNCH CROORnCCHHNOHn-1N-端氨基酸 C-端氨基酸ORnCCHH2NOHH2NCHCRONHNH2+H+NH2NH2氨基酸酰肼C-端氨基酸（二

19、）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定2C蛋白質的共價結構系統（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定2C C末端末端AA AA 氨基醇氨基醇 還原法還原法硼氫化鋰硼氫化鋰蛋白質的共價結構系統 肽鏈外切酶肽鏈外切酶: :從多肽鏈從多肽鏈C-C-端逐個水解端逐個水解 根據不同反應時間釋放出的根據不同反應時間釋放出的AAAA種類和數量種類和數量 蛋白質蛋白質C-C-末端殘基順序。末端殘基順序。 四種羧肽酶：四種羧肽酶：A,B,CA,B,C和和Y Y； A A和和B(B(胰臟胰臟) )、C(C(柑桔葉柑桔葉) )、Y(Y(面包酵母面包酵母) ) A:A:除除Pro/Ar

20、g/Lys/Pro/Arg/Lys/外所有外所有C-C-末端末端AAAA殘基殘基 B: B:只水解只水解ArgArg和和LysLys為為C-C-末端殘基的肽鍵末端殘基的肽鍵 羧肽酶法羧肽酶法（二）、末端氨基酸殘基的鑒定（二）、末端氨基酸殘基的鑒定2C蛋白質的共價結構系統（三）、二硫鍵的斷裂（三）、二硫鍵的斷裂 鹽酸胍鹽酸胍/ /尿素解離多肽鏈間的非共價力。尿素解離多肽鏈間的非共價力。 應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽應用過甲酸氧化法或巰基還原法拆分多肽鏈間的二硫鍵。鏈間的二硫鍵。蛋白質的共價結構系統1 1、酸水解、酸水解（四）、氨基酸組成的分析（四）、氨基酸組成的分析2 2、堿水解、堿水解

21、蛋白質的共價結構系統1 1、酶解法酶解法: : 內切酶：內切酶：胰蛋白酶胰蛋白酶、糜蛋白酶、糜蛋白酶、 胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶胃蛋白酶、嗜熱菌蛋白酶 外切酶：羧肽酶和氨肽酶外切酶：羧肽酶和氨肽酶多肽鏈的選擇性降解多肽鏈的選擇性降解 （五）、多肽鏈的部分裂解和（五）、多肽鏈的部分裂解和 肽段混合物的分離純化肽段混合物的分離純化蛋白質的共價結構系統 R1=Lys（K）和）和Arg（R） 專一性較強，水解速度快專一性較強，水解速度快 R2=Pro（抑制）（抑制）NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點胰蛋白酶胰蛋白酶trypsin蛋白質

22、的共價結構系統 R1=Phe（F）、）、 Trp（W）Tyr（Y）等疏水性）等疏水性AA Leu、Met和和His稍慢稍慢 R2=Pro（抑制）（抑制） pH8-9NH CH COR4NH CH COR3NH CH COR2NH CH COR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點糜蛋白酶糜蛋白酶/胰凝乳蛋白酶（胰凝乳蛋白酶（chymotrypsin）水解速度與相鄰水解速度與相鄰AAAA性質有關性質有關: : 酸性：酸性：-/-/堿性：堿性：+ +蛋白質的共價結構系統 R2=Phe（F）、）、 Trp（W）、）、 Tyr（Y）、）、Leu（L）、）、Ile（I）、）、Met（M）、）、Val（V）及其它）及

23、其它疏水性強的疏水性強的AA水解速度較快水解速度較快NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點R2= Pro或或Gly，不水解，不水解R1或或R3=Pro，抑制水解，抑制水解嗜熱菌蛋白酶嗜熱菌蛋白酶（thermolysin)蛋白質的共價結構系統 R1和和/或或R2Phe（F）、）、Trp（W）、）、Tyr（Y）、）、 Leu（L）及其它疏水性）及其它疏水性AA水解水解速度較快速度較快 R1=Pro（抑制）（抑制） pH2NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點胃蛋白酶胃蛋白酶Pepsin蛋白質的共價結

24、構系統NHCHCOR4NHCHCOR3NHCHCOR2NHCHCOR1肽鏈肽鏈水解位點水解位點羧肽酶和氨肽酶羧肽酶和氨肽酶蛋白質的共價結構系統2 2、化學裂解法、化學裂解法 溴化氰水解法溴化氰水解法(Cyanogen bromide)選擇性地切割由選擇性地切割由MetMet羧基形成的肽鍵。羧基形成的肽鍵。CH3S：CH2CH2CHNHCNHCHCOOR+BrC+NBr-CH3S+CH2CH2CHNHCNHCHCOORCNCH3SCN CH2CHNHCNHCHCOORCH2+H2O+CH2CHNHCOCH2OH3N+CHCOR高絲氨酸內酯（五）、多肽鏈的部分裂解和（五）、多肽鏈的部分裂解和 肽段

25、混合物的分離純化肽段混合物的分離純化多肽鏈的選擇性降解多肽鏈的選擇性降解蛋白質的共價結構系統 NH2OH斷裂：斷裂： 較專一性斷裂較專一性斷裂Asn-Gly之間的肽鍵之間的肽鍵 Asn-Leu及及Asn-Ala鍵也能部分斷裂鍵也能部分斷裂 蛋白質的共價結構系統3 3、肽段的分離純化：、肽段的分離純化： 凝膠過濾、凝膠電泳和凝膠過濾、凝膠電泳和HPLCHPLC法法蛋白質的共價結構系統N-N-端分析法端分析法特點：能夠不斷重復循環，將肽鏈特點：能夠不斷重復循環，將肽鏈N-N-端端氨基酸殘基逐一進行標記和解離。氨基酸殘基逐一進行標記和解離。1 1、 （六）、肽段氨基酸序列的測定（六）、肽段氨基酸序列

26、的測定Edman于于1950年首先提出。年首先提出。蛋白質的共價結構系統PITCPTC-肽肽蛋白質的共價結構系統2 2、氨肽酶法或羧肽酶法、氨肽酶法或羧肽酶法3 3、質譜法（、質譜法（MSMS） 靈敏度高、所需樣品少、測定速度快靈敏度高、所需樣品少、測定速度快蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統蛋白質的共價結構系統核糖體核糖體蛋白質鏈蛋白質鏈4.4.根據核苷酸序列的推定法根據核苷酸序列的推定法蛋白質的共價結構系統（七）、肽段在多肽鏈中次序的決定重疊肽（重疊肽（overlaping peptide）蛋白質的共價結構系統 胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈胃蛋白酶處理沒有斷開二硫鍵的多肽鏈 經電泳分離各肽段經電泳分離各肽段 用過甲酸斷開二硫鍵，含有用過甲酸斷開二硫鍵，含有-S-S-的肽段帶電性的肽段帶電性質發生變化，轉向質發生變化，轉向90二次電泳，曾含二硫鍵二次電泳，曾含二硫鍵的肽段遷移率發生變化的肽段遷移率發生變化 然后同其它方