1、核酸適配子在臨床研究中的進展彭艷馮茂輝謝偉自 1990 年，Tuerk 和 Ellington 用指數富集的配體系統進化 （systematic evolution 01 ligands by exponential enrichment . SELEX）技術分別篩選出能與 T4DNA聚合酶和有機染料特異結合的 隨機寡核苷酸后，用于篩選的靶物質越來越廣，從核酸蛋白擴展到小分子有機物，以及完整的細胞病毒等。其在基礎研究、臨床研究及藥物開發中的應用也不斷增加。本文對核酸適配子及其在臨床診斷和治療的應用作一綜述。一適配子及其特點適配子是通過SELEX技術從體外人工合成的大容量單鏈隨機寡核苷酸文庫中經

2、過多輪 篩選和富集獲得的，能與靶分子高親和力和高特異性結合的寡聚核苷酸。它能與一系 列靶物質特異地結合，其親和力和特異性能與抗體媲美，甚至優于抗體，且具備抗體所不具備的一些優點，如核酸適配子的分子量小、制備簡單、生產不依賴于動物、成本低、易重 復、毒性低、無免疫源性，即使針對有毒物質也可以篩選出其相應的適配子適配子在實際應用中也具有許多優點：（1）高親和力和高特異性： 適配子的解離常數（kd）一般在納摩爾到皮摩爾，能夠區分一個羥基或甲基的區別，其親和力和特異性是別的配基無法比擬的；（2）靶分子范圍廣：從理論上說，只要核苷酸庫中的系列有足夠的多樣性，就可 以通過SELEX技術篩選出相應的適配子。

3、酶等較大的蛋白質分子、金屬離子、有機染料、 核苷、多肽等小分子物質以及完整的細胞和病毒顆粒和細菌孢子都可以是其靶分子；（3）體外篩選易人工合成：隨著SELEX技術的不斷完善，適配子的篩選周期越來越短；人工合成的適配子純度高，有極佳的準確性和重復性，幾乎消除了制備的批間誤差；（4）易修飾性：適配子為寡聚核苷酸片段，可以在保持其原有的生物學活性的基礎上進行精確的位點修飾， 它可以被熒光染料、放射性同位素、生物素標記、細胞毒素和藥物等連接，提高了其在臨床 診斷和治療中的應用。（5）分子量小，穩定性好，對環境溫度不敏感，易保存。適配子比抗 體的分子小，易通過細胞膜進入細胞內，能更方便地檢測細胞內的靶分

4、子；經過修飾的適配子穩定性好，在體內的半衰期長，利于體內診斷和治療；適配子變性和復性可逆且速度快， 可以反復使用、長期保存和室溫運輸。二、適配子在臨床診斷中的應用 適配子感受器在診斷發展方面具有許多優點，其作為生物組分在診斷應用中提供了許多有利因素，例如未經修飾適配子具有易再生的特點，另外，適配子的易標記性使其在診斷中更具靈活性。如今的許多臨床診斷技術仍然依賴于免疫學技術如酶聯免疫吸附試驗。除了這些 經典的檢測外，可以利用核酸適配子檢測蛋白、細胞及分子成像，具有良好的敏感性和特 異性。1. 相關蛋白的檢測：表皮生長因子受體（epidermalgrowth factor receptor , E

5、GFR蛋白由28個外顯子編碼的跨膜蛋白組成，是erB酪氨酸激酶受體家族中的一員，其與腫瘤的發生、發展有明顯的相關性。“等 篩選出抗一 EGFR適配子，其經金納米微粒 （GNPs）修飾后可以特異地、定量地檢測到細胞中的EGFR蛋白。Fang等在血小板源性生長因子（platelet derived growth factor , PDGF）B鏈的核酸適配子兩端分別連接熒光基團和熒光淬滅基團，在腫瘤細胞培養上清液中成功地檢測到皮摩爾水平濃度的PDGF而且能夠準確地分辨出PDGF分子的三種二聚體，顯示出高度的選擇性、敏感性及簡便易行性。2. 細胞檢測：核酸適配子能夠特異地結合細胞表面標記物，已被用于開

6、發多效價抗體類似物和流式細胞儀分析。Zhang等 篩選出的熒光標記的特異結合人CD30蛋白的RNA適配子，通過流式細胞術檢測后結果顯示：低濃度 （0 . 3 nM）適配子就能特異地、敏感地檢測到 表達CD30的淋巴細胞，與臨床公認的診斷探針-抗體探針效果一樣， 從而認為該適配子可取代抗體作為檢測表達 CD30淋巴細胞的探針。GNPS標記的適配子除具有適配子高選擇性及高 親和力等本身特性外，同時也具有GNPs的光譜優勢，因而可以敏感地檢測出靶細胞。Medley 等將特異結合人急性淋巴細胞白血病細胞(CCRF-CEM cell)的適配子與GNPs結合，成功地檢測出CCRCEM細胞。適配子-金納米比

7、色分析法可以靈敏地辨別靶細胞和對照細胞， 檢測出靶細胞，可成為診斷疾病強有力的工具。3分子成像：核酸適配子的分子量小、組織滲透性好、血漿清除率高、信噪比高、成像效 果好，特別適合作為非侵入性診斷成像試劑。跨膜糖蛋白MUC一 1高表達于惡性上皮細胞，已被認為是腫瘤標記物之一。Pieve等用Tc標記抗MUC一 1適配子用于乳腺癌裸鼠模型成像分析，發現放射性同位素 Tc標記的適配子具有較高的攝取率和清除率，對惡性上皮腫瘤 具有診斷應用價值。Kim等將GNPS結合到抗前列腺特異性膜抗原(PSMA)適配子上用于計算機斷層(CT)掃描，結果顯示GNPS能夠增強CT成像。Hwang等成功地把核仁蛋白適配子

8、AS1411 和用熒光素標記的鈷一鐵納米顆粒結合起來用于腫瘤的影像學診斷。三、適配子在臨床治療中的應用適配子在臨床治療中的應用方式和單克隆抗體大致相同。與單克隆抗體的生產方法不一樣的是適配子在體外篩選不需要生物體，生產過程中可以很好地控制各種反應條件。另外相對于其他寡核苷酸，適配子具有獨特的優勢，例如，反義寡核苷酸或者 siRNA的治療靶標在細胞內，而適配子的治療靶標可以在細胞內、細胞外或者細胞表面。1 .抑制性核酸適配子：血管內皮生長因子(vascular endothelialgrowth factor, VEGF)在腫瘤的發生、發展和轉移過程中起重要作用，其促進實體腫瘤血管形成，與惡性腫

9、瘤血行轉移等臨床病理因素相關。目前，抑制血管生成為抗癌藥的主要靶標之一，故抗VEGF適配子具有治療實體瘤的潛能。有研究表明PDGF-B的適配子在動物模型中可以降低與血管生成相關疾病的發生、發展。Mi等 篩選的OP R3RNA適配子不僅在體外能抑制 MDA- MB-23I細胞的黏附、浸潤及轉移，在動物模型體內也可以抑制腫塊的生長。2. 可調控核酸適配子：在臨床應用中，藥物快速降解能夠減少其對身體的毒害作用。未經修飾的適配子半衰期短，在血漿中能夠快速清除。REG 1是第一個被稱為可調控的核酸適配子，由凝血酶因子 IXa的RNA適配子(RBO06)和與RB006相互補的單鏈 RNA寡聚核苷酸 (RB

10、007)構成。通過RB006與RB007相互競爭使 REG-1結構發生改變從而抑制凝血酶因子 IXa，達到抗凝的作用。目前，REG 1已經進入I期和n期的臨床試驗 ，I a期I b期臨床試驗分別對未患心血管疾病和患心血管疾病的患者進行抗凝治療，未發現毒性反應”。丨c期臨床試驗顯示不同劑量的REG-1具有不同的抗凝作用3. 多價體核酸適配子：抗體的低聚反應能夠增加抗體的親和力，活化感受受體，從而提高效力。Shi等 首次用抗果蠅 B52適配子證實適配子的多聚體可以增加其親和力。SantulliMarotto等篩選的細胞毒性 T淋巴細胞相關抗原-4(CTLA-4)是第一個有治療潛能的多效價 適配子。

11、該適配子的四聚體結構能調控體內的免疫功能，應用于免疫治療，有望成為高效的抗腫瘤藥物。4. 運輸工具核酸適配子：已有研究表明，將siRNA連接到適配子上并特異性地運輸siRNA到其靶細胞上能夠達到治療的目的。另外，適配子同樣可以靶向運輸毒素、放射性同位素和化療藥物。特別是在運輸治療藥物時比非靶向治療更具優勢。首先，靶向運輸將減少對正常組織或細胞的毒副作用。其次，靶向運輸藥物可以顯著減少有效治療量。McNamara等首次在動物模型中用 PSMA適配子來靶向運輸針對 Plk 一 1和Bcl 一 2的siRNA治療前列腺癌，結果發現：運輸siRNA的適配子能夠促使細胞凋亡，使得表達PSMA勺細胞和組織

12、退化，而對不表達PSMA勺細胞和組織無影響。Bagalkot等將阿霉素直接連接到 PMSA適配子A10上 用以運輸到細胞內，可以促進表達PSMA的細胞凋亡。Dhar等同樣用適配子精確地將順靶向運輸到前列腺癌細胞中。Zhou等 將HIVgpl20適配子一 siRNA嵌合體用于感染 HIV的細胞，發現能同時通過適配子和 siRNA抑制艾滋病病毒復制， 將該適配子結合到 HIVgpl60上, 同樣也可以抑制 HtV-1復制，降低傳染性。Hua ng等 將阿霉素連接到 PTK7適配子sgc8c上, 發現阿霉素一適配子復合體對高表達目的蛋白的細胞選擇性高，提高了化療療效。四、展望隨著組織切片 SELEX

13、、復合靶SELEX、基因組SELEXLIj 、活細胞SELEX等多種技術形式 的出現，核酸適配子的應用前景也將更加廣泛。核酸適配子作為目前已用于化學制藥的核苷酸分子之一，具有很多優越性，對于疾病診斷和發病機制的基礎科學研究也有顯著的優勢。適配子同樣也可以取代抗體用于免疫組化和酶聯免疫吸附實驗來分析組織和血液樣本。雖然適配子應用于臨床相對較新，特別是用于體內成像診斷方面還存在一些問題，但其優點及其相關研究意味著其將具有更廣闊的臨床應用前景。參考文獻1 BaldrichE ， RestrepoA ， O SullivanCK . Aptasensordevelopment : elucidatio

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