1、工業微生物育種簡介劉春波-12生工2-摘要：本文綜述了工業微生物遺傳育種的歷史地位，介紹了遺傳育種的方法和機理，并對其前景進行了展望。微生物遺傳育種，所謂微生物遺傳育種，即菌種改良，是運用遺傳學原理和技術對某種具有特定生產目的的菌株進行改造，去除不良性質，增加有益新性狀，以提高產品的產量和質量的一種育種方法1，使我們獲得所需要的高產、優質和低耗的菌種，其目的是改良菌種的特性，使其符合工業生產的要求。關鍵詞：工業微生物；遺傳育種；方法；機理工業微生物菌株選育在工業發酵中占有重要地位。用于工業生產的微生物菌種，最好具有以下特征：1.在遺傳上必須是穩定的。2.易于產生許多營養細胞、孢子或其它繁殖體3

2、.必須是純種，不應帶有其它雜菌及噬菌體。4.種子的生長必須旺盛、迅速。5.產生所需要的產物時間短。6.比較容易分離純化。7.有自身保護機制，抵抗雜菌污染能力強。8.能保持較長的良好經濟能力。9.菌株對誘變處理較敏感，從而提高產量潛力高2。1 歷史地位菌種選育技術的廣泛應用為我們提供了各種類型的突變菌株，使得在食品工業、醫藥、農業、環境保護、化工能源、礦產開發等領域產生眾多新的產品，促使傳統產業的技術改造和新型產業的產生，同時使諸如抗生素、有機酸、維生素、色素、生物堿、激素以及其它生物活性物質等產品的產量成倍甚至成千萬倍地增長，并且產品的質量也不斷的提高。與此同時鏈霉素、土霉素、金霉素和氯霉素等

3、抗生素也大規模的生產起來；在代謝控制育種的推動下使得產氨基酸、核苷酸、有機酸等次生代謝產物的高產菌株大批投入生產；由基因工程構建的工程菌株使得微生物次生代謝產物生產能力迅速提高，而且生產出微生物本生不能生產的外源蛋白質，如胰島素、生長激素、單克隆抗體和細胞因子等等。由此可見工業微生物遺傳育種技術是工業發酵工程的核心技術，在其作用下人們獲得了許多的高產優質菌株，為生產實踐發展起了強大的推動作用。2 機理及方法2.1 自然選育就是不經人工處理，利用微生物的自然突變進行菌種選育的過程稱為自然選育。這類突變沒有人工參與并非是沒有原因的，一般認為自然突變有兩種原因引起，即多因素低劑量效應和互變異構效應。

4、所謂多因素低劑量效應，是指在自然環境中存在著低劑量的宇宙射線、各種短波輻射、低劑量的誘變物質和微生物自身代謝產生的誘變物質等作用引起的突變。互變異構效應是指四種堿基第六位上的酮基或氨基的瞬間變構，會引起堿基的錯配3。自然突變可能會產生兩種截然不同的結果，一種是菌種退化而導致目標產量或質量下降；另一種是對生產有益的突變。為了保證生產水平的穩定和提高，應經常地進行生產菌種自然選育，以淘汰退化的，選出優良的菌種。在工業生產上，由于各種條件因素的影響，自然突變是經常發生的，也造成了生產水平的波動，所以技術人員很注意從高生產水平的批次中，分離高生產能力的菌種再用于生產。同時也可利用自發突變而出現的菌種性

5、狀的變化，去選育優良的菌株，如在味精發酵被噬菌體污染過程中，所選出的抗噬菌體菌株。自然選育是一種簡單易行的選育方法，可以達到純化菌種，防止菌種退化，穩定生產，提高產量的目的。但是自然選育的效率低，因此經常要與誘變育種交替使用，以提高育種效率。酒精發酵是最早應用微生物遺傳學原理于微生物育種實踐，推廣了自然選育的純系良種，扭轉了酒精生產不穩定的現象。這是最早應用微生物遺傳學原理，進行育種實踐，提高發酵水平的一個實例4。這樣低的突變率導致自然選育耗時長，工作量大，影響了育種工作效率，在這種情況下，出現了誘變育種技術。2.2 誘變育種微生物的誘變育種，是以人工誘變手段誘變微生物基因突變，改變遺傳結構和

6、功能，通過篩選，從多種多樣的變異體中篩選出產量高、性狀優良的突變株，并且找出發揮這個變株最佳培養基和培養條件，使其在最合適的環境下合成有效產物2。誘變育種和其他育種方法相比，具有速度快、收益大、方法簡單等優點，是當前菌種選育的一種主要方法，在生產中使用的十分普遍。但是誘變育種缺乏定向性，因此誘變突變必須與大規模的篩選工作相配合才能收到良好的效果。目前，人們用于誘變育種的誘變因素有物理因素和化學因素，前者包括紫外線、激光、X-射線、-射線和中子等；后者主要是烷化劑(包括EMS，EI，NEU，NMU，DES，MNNG，NTG等)，天然堿基類似物，亞硝酸和氯化鋰等。在物理誘變因素中，紫外線比較有效、

7、適用、安全，其他幾種射線都是電離性質的，具有穿透力，使用時有一定的危險性，化學誘變劑的突變率通常要比電離輻射的高，并且十分經濟，但這些物質大多是致癌劑，使用時必須十分謹慎1。目前，多種誘變劑的誘變效果、作用時間、方法都已基本確定，人們可以有目的、有選擇地使用各種誘變劑以達到預期的育種效果。誘變育種也可采用復合誘變，即兩種或多種誘變劑的先后使用同種誘變劑的重復作用；兩種或多種誘變劑的同時使用。普遍認為復合誘變具有協同效應，如果兩種或兩種以上誘變劑合理搭配使用，復合誘變較單一誘變效果好。雖然復合因子較單一因子誘變效果有很大優勢，但因為目前大多微生物，尤其是抗生素產生菌的遺傳背景不清楚，往往對誘變劑

8、，特別是復合誘變劑的選擇使用，帶有很大的盲目性6。通過誘變處理，在微生物群體中，會出現各種突變型個體，但從產量變異的角度來講，其中絕大多數都是負變株。要從中把極個別的、產量提高較顯著的正變株篩選出來，可能要比沙里淘金還難。因此突變株的分離和篩選是誘變育種的關鍵，體現了突變不定向性和篩選定向性。為了獲得我們所需的突變株，使得突變株的新表型得以表達，淘汰原養型或負變株，必須設計一個良好的篩選培養基和確定合適的培養條件。篩選的步驟主要分初篩和復篩，初篩以量為主，選留較多有生產潛力的菌株，復篩以質為主，對少量潛力大的菌株的代謝產物量進行精確測定7。篩選的方法依據目的物不同而異，常用的方法有濃度梯度法、

9、影印平板法、生長譜法、瓊脂平板活性圈法、紙片法、夾層培養法、循環篩選法以及與電腦化、智能化的高效篩選技術相結合的現代方法。2.3 雜交育種雜交是指在細胞水平上進行的一種遺傳重組方式。雜交育種是利用兩個或多個遺傳性狀差異較大的菌株，通過有性雜交、準性雜交、原生質體融合和遺傳轉化等方式，而導致其菌株間的基因的重組，把親代的優良性狀集中在后代中的一種育種技術。通過雜交育種可以實現不同的遺傳性狀的菌株間雜交，使遺傳物質進行交換和重新組合，改變親株的遺傳物質基礎，擴大變異范圍，獲得新的品種。同時不僅可克服因長期誘變造成的菌株活力下降，代謝緩慢等缺陷，也可以提高對誘變劑的敏感性，降低對誘變劑的“疲勞”效應

10、2,8。本小節將從有性雜交、準性雜交和原生質體融合三種常見的育種技術來介紹雜交育種。2.3.1 有性雜交有性雜交是指不同遺傳型的兩性細胞間發生的接合和隨之進行的染色體重組，進而產生新遺傳型后代的一種育種技術。凡能產生有性孢子的真菌，原則上都能像高等動、植物雜交預育種相似的有性雜交方法來進行育種7。一般方法是把來自不同親本、不同性別的單倍體細胞通過離心等方式使之密集地接觸，就有更多的機會出現種種雙倍體的有性雜交后代。在這些雙倍體雜交子代中，通過篩選，就可以得到優良性狀的雜種。2.3.2 準性雜交準性雜交是在無性細胞中所有的非減數分裂導致DNA重組的過程，微生物雜交僅轉移部分基因，然后形成部分重組

11、子，最終實現染色體交換和基因重組，在原核和真核生物中均有存在。準性雜交的方式主要有結合、轉化和轉導，其局限性在于等位基因的不親合性。2.3.3 原生質體融合原生質體融合就是把兩個不同親本菌株的細胞壁，分別經酶解作用去除，而得到球狀的原生質體，然后將兩種不同的原生質體置于高滲溶液中，由聚乙二醇（PEG）助融，促使兩者高度密集發生細胞融合，進而導致基因重組，就可由此再生細胞中獲得雜交重組菌株9。原生質體融合技術具有許多常規雜交方法無法比擬的獨到之處10:由于去除了細胞壁，原生質體膜易于融合，即使沒有接合、轉化和轉導等遺傳系統，也能發生基因組的融合重組；融合沒有極性，相互融合的是整個胞質與細胞核，使

12、遺傳物質的傳遞更為完善；重組頻率高，易于得到雜種；存在著兩株以上親株同時參與融合并形成融合子的可能11；較易打破分類界限，實現種間或更遠緣的基因交流12；同基因工程方法相比，不必對試驗菌株進行詳細的遺傳學研究，也不需要高精尖的儀器設備和貴的材料費用等。由于以上優點，迄今，這項技術不僅在基礎研究方面，而且在實際應用上，均取得了引人注目的成績。隨著生物學研究手段的不斷創新，該技術的基本實驗方法逐步完善。經過多年的實際應用，證明微生物原生質體融合確是一項十分有用的育種技術13。通過原生質體融合改良工業微生物菌株的遺傳本質是培育高產、優質、抗逆性強的良種的一種行之有效的手段，可以與誘變育種等結合使用，

13、同時還需要不斷積累有關基礎資料，克服育種盲目性，以期達到工業生產的新需求。1960年法國的Barsi14研究小組在培養兩種不同動物細胞混合時發現了自發融合現象，同時日本的Dkada15發現仙臺病毒可誘發內艾氏腹水病細胞彼此融合， 從而開始了細胞融合的探索。1974 年匈牙利的Fereczy16采用離心力誘導的方法實現了白地霉(Creotrichumcandidum)營養缺陷型突變株原生質體的融合; 隨后人們相繼用NaCl、KCl Ca( NO3) 2 等作為誘變劑進行融合， 但融合率比較低; 1978 年國際工業微生物遺傳學討論會提出了原生質體的融合問題， 使這一技術迅速擴展到了育種領域; 1

14、979 年匈牙利的Pesti17首先提出了運用融合育種技術提高青霉素的產量， 從而開創了原生質體融合技術在工業微生物育種實際工作中的應用。原生質體融合育種基本步驟為：標記菌株的篩選和穩定性驗證原生質體制備等量原生質體加聚乙二醇促進融合涂布于再生培養基，再生出菌落選擇性培養基上劃線生長，分離驗證，挑取融合子進一步試驗、保藏生產性能篩選。3 展望工業微生物遺傳育種在基因工程、細胞工程、蛋白質工程和酶工程等現代生物技術的支持下，創造出許許多多的設計技巧、科技含量高、目的性強、勞動強度低、效果顯著的育種方法，為人類獲得穩定性好、高產、新種類的工程菌株和開發新藥和工業產品，以及提高產品產量和質量提供了有

15、力的保障。我們有理由相信微生物遺傳育種學將得到更加全面的縱橫發展，將為生產實踐提供更多的優良菌株，將在食品工業、醫藥、農業、環境保護、化工能源、礦產開發等領域發揮更加重要的作用。參考文獻1 陳三鳳，現代微生物遺傳學2談談你對工業微生物育種的看法2008，08.3 賀淹才.基因工程技術指南M.北京:科學出版社,1998, 924 施巧琴,吳松剛.工業微生物育種學M.2 版,北京:科學出版社,2003: 2- 36 黃大肪,林敏.農業微生物基因工程北京：科學出版社，2001.7 吳乃虎.基因工程原理M.北京: 科學出版社（第二版）8 沈祖嘉,沈仁權.分子遺傳學M上海：復旦大學，19889 施巧琴,

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