1、.發酵工藝學課程論文題目名稱：發酵法生產維生素c 姓名：張曉偉 所在學院：食品學院 電話導師：陳國剛 導師所在單位：石河子大學食品學院 專業：食品加工與安全 精品.發酵法生產維生素c摘要：維生素c又稱l-抗壞血酸是高等靈長類動物與其他少數生物的必需營養素。抗壞血酸在大多的生物體可借由新陳代謝制造出來，但是人類是最顯著的例外。最廣為人知的是缺乏維生素c會造成壞血病。在生物體內，維生素c是一種抗氧化劑，保護身體免于自由基的威脅，維生素c同時也是一種輔酶。其廣泛的食物來源為各類新鮮蔬果。維生素c為酸性己糖衍生物，是稀醇式己糖酸內酯，vc主要來源新鮮水果和蔬菜，是高等靈長類動

2、物與其他少數生物的必需營養素。vc有l-型和d-型兩種異構體，只有l-型的才具有生理功能，還原型和氧化型都有生理活性。其結構是一種含有6個碳原子的酸性多羥基化合物，分子式為c6h8o6，分子量為176.1。天然存在的抗壞血酸有l型和d型2種，后者無生物活性。維生素c是呈無色無臭的片狀晶體，易溶于水，不溶于有機溶劑。在酸性環境中穩定，遇空氣中氧、熱、光、堿性物質，特別是由氧化酶及痕量銅、鐵等金屬離子存在時，可促進其氧化破壞。氧化酶一般在蔬菜中含量較多，故蔬菜儲存過程中都有不同程度流失。但在某些果實中含有的生物類黃酮，能保護其穩定性。維生素 c 是生命的必需營養元素, 具有多種生理功能, 因而改進

3、維生素 c 生產工藝、提高產品產量和質量成為目前維生素 c 研究的熱點。目前, 國內維生素 c 最主要的生產方式是二步發酵法。本文對維生素 c 二步發酵法的生產過程及目前對這一生產工藝改進的主要技術措施和研究方向作一介紹關鍵詞：維生素c 生產工藝 二步發酵法 主要技術精品.前言精品. 維生素 c 是簡單結構的有機化合物,與單糖有密切關系。研究表明植物中含有抗壞血酸氧化酶，能催化維生素 c 氧化，維生素 c 廣泛分布在植物組織中,新鮮水果及蔬菜中含量尤多。多數哺乳類和禽類也都能由葡萄糖合成足夠數量的 l-抗壞血酸。但人、豚鼠、猴子、蝙蝠、某些爬行動物及大多數人工養殖的魚類甲殼類體內缺乏古洛糖酸內

4、酯氧化酶, 不能將古洛糖酸內酯轉化成 l-抗壞血酸，不能生物合成維生素 c, 動物體內貯藏維生素 c 量不大，它們必須經常從環境或食物中攝取維生素 c 補充。維生素 c 廣泛存在于新鮮水果及綠葉蔬菜中，尤以獼猴桃、板栗（生）、草莓、橘子、刺梨及辣椒等含量豐富。中草藥如醋柳果、蒼耳子等也含有很多維生素 c。 維生素 c 純品為白色單斜晶系的結晶或結晶性粉末，無臭味酸，久置色微黃。易溶于水，略溶于乙醇，不溶于乙醚、氯仿。它是一種不飽和的多羥基六碳化合物，以內酯形式存在，在 2，3 位碳原子之間烯醇式羥基上的氫可游離出來，故具有酸性。維生素 c 具有很強的還原性，故極不穩定，容易為熱或氧化劑所氧化，

5、在中性或堿性溶液中尤甚；光、微量重金屬（特別是 fe2+、cu2+）或熒光物質（如核黃素）更能促進其被氧化。微量金屬元素對維生素 c 的氧化分解的催化作用，以銅離子為甚，其順序為 cu2+co2+mn2+zn2+fe2+。在低于p h5.5 的溶液中，維生素 c 較為穩定；所以提取維生素 c 時，草酸和偏磷酸是較好的穩定劑 維生素c的發酵是指通過發酵作用將原料轉化為維生素c，再通過生物分離技術將其從發酵液中分離提純，獲取滿足要求的維生素c產品。維生素c的發酵過程中包含菌種的培育、菌種的保藏、種子的制備、發酵動力學、發酵環節的控制和染菌及防治六個方面。概括地說，在發酵的整個過程中要選育出優秀的發

6、酵菌種并采取合理有效的方法予以保藏，保持其優良性狀；在實際生產時要對菌種進行擴大培養，滿足生產上對發酵菌的數量要求；對于發酵還應全面的考慮發酵的消耗、產率問題，并通過適當的控制方法提高效率；染菌和污染是發酵過程中的一個非常嚴重的問題，需要嚴格控制，頻繁檢測確保發酵罐安全，避免或較小損失。v c自四十年代開始工業化生產,其生產技術是德國人r eichstdn于1933年發明的(簡稱 萊 氏珠),即以0 一山梨醇為原料,經過醋酸菌發酵生成山梨糖,再經過酮化、化學氧化 和水解得 到2一酮基一l一古龍酸,再經化學轉化得到v c.其工藝比較復雜,而且消耗大量苯、丙硯和發煙硫酸等易燃易爆和有毒原料，此法至

7、今仍被延用。維生素 c 是生命的必需營養元素, 具有多種生理功能, 隨著維生素 c 實驗應用范圍的增加, 市場需求量日益增大, 人們對維生素 c 實驗生產技術不斷進行研究改進。維生素 c 實驗的生產技術經歷了濃縮提取、化學合成和生物發酵三個階段。以前, 維生素 c 實驗是從檸檬、辣椒等天然植物中提取的, 價格昂貴且生產量低, 遠不能滿足市場需求, 現已退出工業生產。化學合成法主要是萊氏法, 該法工藝路線成熟,原料簡單易得, 產品質量好收率高, 但此法工藝路線長, 難以連續化操作,且需耗費大量有毒、易燃易爆的化學藥品, 既危險又污染環境。微生物二步發酵法具有工藝路線短、“三廢”少、原料單耗低和對

8、設備腐蝕性小等優點。本文就微生物二步發酵法合成維生素 c 實驗的生產工藝改進過程及新的研究方向作介紹。 精品.1 vc的性質、功能和用途1.1性質純vc在常溫下為無色晶體,味酸,易溶于水。vc在結晶狀態尚穩定,而在水溶液中則很不穩定,容易為加熱、氧化所破壞。l_抗壞血酸具有較強的還原性,在體內經抗壞血酸氧化酶的作用可脫氫氧化成l_脫氫抗壞血酸,該脫氫反應是一個可逆反應。還原型的l_抗壞血酸和氧化型的l_脫氫抗壞血酸均具有生理活性,它們構成的一對氧化-還原系統,在細胞代謝中起著重要的生理作用。1.2功能與用途vc在人體中具有廣泛的生理作用:1參與體內氧化還原反應;2對抗自由基損傷;3改善機體免疫

9、功能;4參與膠原蛋白和細胞間質的合成;5參與神經遞質的合成;6參與氨基酸代謝與鐵代謝;7抑制血小板及白細胞活化;等等。因此,vc在壞血病、感冒、心血管缺陷、高膽固醇、糖尿病、精神抑郁癥、危重型克山病等疾病的臨床治療中均具有重要的用途。此外,vc還可以用作食品添加劑、飼料添加劑、某些農作物的催熟劑、化妝品工業防銹劑,等等。2vc的生產技術2.1生產工藝方法的演變過程2.1.1濃縮提取本世紀的二、三十年代，人們對于維生素 c 的結構、性質還不了解，獲取其產品的途徑只是經驗性地由富含“還原性因子”的生物組織如檸檬、胡桃、野薔薇、辣椒、腎上腺等提取獲得。此法生產成本高，產量有限，遠遠不能滿足人類社會日

10、益增長的物質需求。直至五十年代，仍有企業使用此法生產維生素 c。2.1.2 化學合成1933 年，reichstein 等和 ault 等兩個研究小組分別獨立發表了維生素 c的合成方法。從 1937 年開始，以 reichstein 和 grussner 的發明為基礎，建立了以 d-葡萄糖為原料，加氫還原成 d-山梨醇，然后利用一步發酵方法和化學方法合成維生素 c 的“萊氏法”（reichstein procedure），維生素 c 生產開始進入化學合成階段。“萊氏法”生產的工藝流程主要包括以下五個步驟： 1）d-葡萄糖在鎳的催化作用下，高溫高壓，加氫還原成 d-山梨醇； 2）d-山梨醇經微生

11、物如生黑葡萄糖酸桿菌（gluconobacter melanogenus）或弱氧化醋酸桿菌（acetobater suboxydans）發酵氧化成 l-山梨糖； 3）l-山梨糖在丙酮和硫酸的作用下，經酮化生成雙丙酮-l-山梨糖精品.（diacetone-l-sorbose 簡稱雙酮糖），生產上俗稱丙酸化。再用苯或甲苯提取，提取液經水法除去單酮山梨糖后，蒸去溶劑而后分離出雙酮糖； 4）雙酮糖在高錳酸鈉氧化，鉑催化下，經水解生成 2-酮基-l-古龍酸（2-keto-l-gulonic acid）； 5）2-酮基-l-古龍酸通過烯醇化和內酯化，在酸性或堿性條件下，轉化生成維生素 c。 萊氏法生產的v

12、c產品質量好、收率高,而且生產原料(葡萄糖)便宜易得,中間產物(如雙丙酮_l_山梨糖)化學性質穩定,但是萊氏法也存在著不少缺陷,諸如生產工序繁多、勞動強度較大,容易造成環境污染,等等。為此,自上世紀60年代起,各國學者一直致力于萊氏法的改進7,20,并取得了很多成果,有的已用于vc工業生產實踐。2.1.3微生物發酵法六十年代以后,各國生產企業及科學家開始探索以細菌生物酶轉化的方法來取代“萊氏法”，相繼提出了諸多反應路線，并在此基礎上對有關反應工藝的問題進行了探索。已成功應用于大生產的細菌發酵法是我國七十年代初開發的“二步發酵法”。 由中國科學院微生物研究所、北京制藥廠、東北制藥總廠尹光琳、寧文

13、珠等人發明的“二步發酵法”從七十年代后期開始正式投產，逐漸在國內生產企業普遍采用，現在國內四大維生素 c 生產企業都采用此法。二步發酵法生產維生素 c 的新工藝 1980 年獲得國家級二等獎。“二步發酵法”已經在中國、歐洲、日本和美國申請了專利，上海三維制藥有限公司當時具有堅實的科研開發力量，1985 年成功地將維生素 c 二步發酵技術轉讓給 f hoffmann-la roche ltd.,switzorland(瑞士豪大邁-羅氏公司)，成為建國以來最大的一項醫藥技術出口項目。該法應用于大生產初時，從 d-山梨醇到維生素c 的總收率平均為百分之四十多，但經過近幾年的激烈市場競爭后，一些廠家可

14、超過百分之六十五，最高為 72%。“二步發酵法”的工藝路線與“萊氏法”不同之處在于采用大、小混合菌發酵法代替化學法轉化 l-山梨糖合成 2-酮基-l-古龍酸。簡化了生產工藝，減少了生產設備投資，降低生產成本，去除了大量有機溶媒等有毒物品的使用，極大地減少了“三廢”的排放。 2.2微生物發酵法的研究進展 嚴格地講,二步發酵法也是一種半微生物發酵半化學合成方法。該工藝方法的發酵原料仍為d-山梨醇,而非葡萄糖;并且,第二步發酵過程中涉及2株菌的混合發酵,其詳細消長機制尚未完全明了。這些都需要人們進一步研究和探索。2.2.1二步發酵法“二步發酵法”是唯一應用于大生產化的細菌發酵途徑。采用生物技術進行發

15、酵生成維生素 c 的重要中間體 2-酮基-l-古龍酸的工藝，使我國二步發酵法處于世界領先水平。目前，通過細胞固定化，原生質融合，遺傳工程等新技術的使用，如中國科學院等離子體物理研究所采用離子束注入技術作為新誘變源篩選出 2-酮基-l-古龍酸高產菌系 ippm-1028、中國科學院沈陽應用生態研究所的新型微生物蛭弧菌 j26轉化山梨糖生產 2-酮基-l-古龍酸發酵條件的研究，使精品.“二步發酵法”工藝研究更加具有國際先進水平。“二步發酵法”經過的是l一山梨糖途徑,即d一葡萄糖加氫生成的d一山梨醇先經細菌轉化為l一山梨糖,后者再經過細菌發酵生成維生素c前體一2一酮基一l一古龍酸(2一keto一l一

16、gulonie一aeid,zklg)。這兩步反應是在不同微生物一t進行的。2.2.1.1大、小菌的相互關系二步發酵法的第二步發酵是采用大菌、小菌2株菌的混合發酵過程,2株菌缺一不可。vc工業生產中常采用的小菌為氧化葡萄糖酸桿菌，大菌為巨大芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌或條紋假單孢桿菌。研究發現,在大、小菌的混合培養中,兩者的增殖是同步進行的。小菌是2- klg合成的主體,大菌一方面直接參與2- klg的合成過程,一方面對小菌的生長起促進作用6。小菌合成的2- klg對大菌的生長增殖有明顯的抑制作用,而大菌的存在卻是小菌的生長增殖和合成2- klg所必需的12。深入研究發現,大菌的胞內液和胞外液均可促進

17、小菌的生長,大菌胞外液中具有該作用的組分的分子量在100kd以上。此外,胞外液還具有促進小菌轉化i-山梨糖生成2- klg的作用,具有該作用的組分包括30- 50kd和大于100kd兩部分,其中前者系一種含鐵和鋅的蛋白質13。目前,這方面研究仍在繼續。2.2.1.2新菌種的選育 優良的菌種對于vc產量和經濟效益的提高具有特殊重要意義。焦鵬等(1997)14運用sma探針技術與hb- hg影印技術篩選得到了一株蛭弧菌j26,搖瓶發酵產生2- klg的發酵單位為50- 60mg/ml。通過優化發酵條件,該菌株的發酵單位已達到83.9- 91.7%15。許安等(1998)16利用離子注入技術選育出的

18、2- klg高產菌系ippm- 1028的山梨糖轉化率比由氧化葡萄糖酸桿菌和巨大芽孢桿菌組成的出發菌系高出18.8%。搖瓶發酵試驗表明,該菌系的發酵周期為60_64h,2_klg濃度可達76g/l17。陳建華等(2002)18篩選得到的優良伴生菌短小芽孢桿菌(bacillus pumilus)與氧化葡萄糖酸桿菌混合發酵生產2_klg的山梨糖轉化率高達90%。尹光琳等(1997)19選育得到的新組合菌系scb329_scb933的發酵周期僅為40_50h,2_klg的發酵單位高達115- 130mg/ml。2.2.1.3工程菌的構建 為了克服傳統二步發酵法的缺點,人們開始嘗試構建優良的產2- k

19、lg工程菌。工程菌的構建主要建立在人們對二步發酵法菌種相關關鍵酶的研究基礎之上。 1974年,markover等提出了微生物合成2-klg的山梨酮途徑學說,認為l-山梨糖在微生精品.物體內先由l-山梨糖脫氫酶(sdh)催化生成i-山梨酮,爾后再由l-山梨酮脫氫酶(sndh)催化生成2- klg。后來,人們從氧化葡萄糖酸桿菌、生黑葡萄糖酸桿菌等中陸續分離純化出了sdh。研究發現,sdh的分子量為46- 60kd,系一個典型的米氏酶,對l-山梨糖的km值為5.27 10- 2 mol/l。sdh的活力與2- klg的合成呈正相關,伴生菌的存在能提高sdh的比活力。shinjoh等(1994)首先從

20、液化醋桿菌中克隆了sdh基因和sndh基因。關于sdh、sndh及其編碼基因的研究為構建優良的產2- klg工程菌奠定了基礎。1998年,saito等將sdh基因和sndh基因導入氧化葡萄糖酸桿菌,結果發現,轉化菌株的2- klg產量比出發菌株有較大提高。這方面研究尚待繼續深入。2.2.2葡萄糖直接發酵法 國外較早就開始了細菌串聯發酵葡萄糖產生2- klg的研究。我國的尹光琳等(1987)采用歐文氏菌和棒桿菌以葡萄糖為發酵原料串聯發酵產生2- klg獲得成功。后來,她們又通過原生質體融合技術得到了歐文氏菌和棒桿菌的融合細胞。搖瓶發酵試驗表明,細胞融合所得的38株融合子中約有40%能將葡萄糖轉化

21、成2_klg。氧化葡萄糖酸桿菌與棒桿菌的休止細胞共固定化串聯發酵葡萄糖產生2- klg工藝的最高轉化率達到37.72%。 1985年,anderson等將棒桿菌的2,5-酮- d-葡萄糖酸(2,5- dkg)還原酶基因轉入歐文氏菌,所得工程菌的葡萄糖轉化率可達到47.7%。后來,又有一些學者進行了類似試驗,并取得初步成果。但是他們所獲得的工程菌都存在著一定的問題,因此至今未見到用于生產實踐的報道。2.2.32- klg的分離提純二步發酵法兩次發酵以后,發酵液中僅含8%左右的2- klg,而殘留菌絲體、蛋白質、多糖或懸浮微粒等雜質的含量卻很高。這給2- klg的分離提純帶來了很大困難,致使后處理

22、費用占總成本的比例較大。目前,vc工業生產中常用的2-klg的分離提純方法有:1加熱沉淀法;2化學凝聚法;3超濾法。2.2.3.2化學凝聚法同加熱沉淀法相比,化學凝聚法采用化學絮凝劑沉淀各種雜質,從而避免了前者能耗較多的問題。季光輝等(1997)研制的新型化學絮凝劑能使vc的總收率提高2.5%。張秋榮等(1999)通過摸索絮凝處理的最佳條件,使2-klg的提取收率比加熱沉淀法高出4.49%。但是發酵液經化學絮凝劑處理以后,離心所得的上清液中仍含有一定量的蛋白質等雜質,這些雜質可能影響2- klg的質量。此外,該方法所使用的化學絮凝劑也可能對環境造成污染。2.2.3.3超濾法超濾法是一種新興的膜

23、處理技術。由于該方法在提高2- klg收率、改善生產環境、減少離子交換樹脂損耗、實現自動化連續化生產等方面具有明顯優勢,因此在2- klg分離提純中的應用日益廣泛。1995年,我國的東北制藥廠從丹麥引進了目前全國最大膜面積的平板超濾裝置。采用這套設備后,2- klg的分離提純成本比原先的化學凝聚法節約了600萬元,并且大大提高了2- klg的收率和生產的自動化、連續化程度34。但是超濾法也具有一定的缺陷。例如,設備一次性投資較大,超濾裝置的通量、抗污染能力尚待提高,等等。目前,國內外學者正在探索反滲透、納濾等新的超濾法工藝。精品.2.2.42- klg的化學轉化由于至今未能找到使葡萄糖直接發酵

24、產生vc的微生物菌種,因此發酵產生的重要中間產物2-klg必須通過化學方法轉化成vc。根據所用化學試劑不同將化學轉化方法分為酸轉化法和堿轉化法。由于前者所用的濃鹽酸對設備腐蝕較嚴重,且易造成環境污染,因此逐漸為后者所取代。堿轉化法的2- klg轉化率可達到92.6%,并且操作簡便,對設備的腐蝕較輕,所以適于vc的規模化生產。2.2.52- klg廢液處理二步發酵法發酵液經分離提純后,仍含有大量的2- klg。如果將其直接排放,不僅浪費了寶貴的2- klg資源,而且會對環境造成嚴重污染。王輝等(1998)運用離子交換樹脂處理廢液,可大大降低其中的雜質(如色素)含量,從而從廢液中再結晶出2- kl

25、g合格產品。王燕等(1999)則對利用2- klg廢液生產草酸進行了小試和中試。3結語 目前，維生素 c 混合生產菌的基礎研究中，由于二步發酵混合大小菌株的作用關系還沒有較科學論證，混合菌發酵 l-山梨糖生成 2-酮基-l-古龍酸的機制只有宏觀的研究，在工業化生產中，糖酸轉化率受培養外界環境因子的影響很不穩定，因其內在微妙機制還沒有研究成果，這給穩定單罐糖酸轉化率的高水平帶來困難。外界環境因子的進一步優化組合技術對工業化生產的進一步發展顯得尤其重要。vc用途廣泛,是我國醫藥出口創匯的最重要產品之一。大力提高vc的生產技術水平,提高vc產品的產量與質量,降低生產成本,不僅有利于我國vc生產工業的

26、發展,而且對整個國民經濟都具有積極的作用。從技術上講,根據目前國內外vc工業生產的現狀,我國應注重以下幾個關鍵問題:3.1利用基因工程等先進手段選育優良的微生物菌種 二步發酵法是我國vc工業生產的當家工藝方法。然而,該方法涉及二步三種菌,操作工序繁瑣,菌種傳代困難,不能直接把葡萄糖作為發酵原料。如果能選育出直接以葡萄糖為發酵原料的優良菌株并應用于生產實踐,那么無疑會對vc生產工業帶來巨大的推動力。理論分析和初步實驗證明,上述設想是切實可行的。在長期的菌種選育實踐中,基因工程這一新興技術顯示出良好的應用前景。今后,應當廣泛采用基因工程等先進手段,爭取早日選育出適于vc工業生產的優良菌種。由于“二

27、步發酵法”的現有轉化率己經達到相當高的水平,因此想繼續提高vc的生產效率應該篩選新的菌株,來簡化現有的生產工藝。精品.3.2影響發酵工藝的因素 微生物發酵是一個極為復雜的生化反應過程。基質、溫度、等因素對微生物的代謝以及菌體生長和產酸的形成都會產生影響。維生素“二步發酵法”是我國獨特的生產工藝,技術路線成熟,工人操作熟練,發酵產率和產品質量均己達到國際水平。但維生素c“二步發酵法”過程十分復雜,干擾因素多,再加之生長自動化、連續化程度差,因而造成生產穩定性不夠,勞動生戶;率較低。此外由于發酵基質濃度低,設備利用率差,這就導致工廠的生產成本偏高。為了解決以上問題,對該發酵工藝動力學的研究是非常必要的。邵軍等和魏東芝等分別于1989年和1992年報道了對維生素c二步發酵過程動力學的研究。他們通過測定發酵體系中大小菌生長規律,以及基質和產酸的變化,建立了簡化的動力學模型,不僅從一定程度上揭示了zklg發酵系統的本質特征,而且可用于分析發酵過程并指導生產。同時,動力學模型的建立也為維生素c二步發酵生產實現連續自動化奠定了理論基礎。近年來國內部分科研單位和制藥廠對于第二步發酵混合菌株的生長和代謝關系作了多方面的探討,并己在生產上應用。根據混