1,谷胱甘肽轉硫酶的制備及動力學研究,實驗內容：（一）親和層析法制備谷胱甘肽轉硫酶（二）測定酶活力、米氏常數(shù)和最大反應速度（三）Folin-酚法測定蛋白質含量，計算比活力,2,谷胱甘肽轉硫酶簡介,谷胱甘肽轉硫酶（GlutathionS-transferases，簡稱GSTs，EC2.5.1.18）廣泛存在于動物和人體的各種組織，哺乳動物肝臟中含量最高，約占肝可溶性蛋白的10%。GST是機體內一組具有重要解毒作用的同工酶家族，均為由兩個亞基組成的二聚體，相對分子質量為4500049000，各同工酶的等電點不同，多為堿性同工酶。,3,兔肝勻漿液及純化樣品SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜,4,GST參與芳香環(huán)氧化物、過氧化物和鹵化物的解毒作用，GST催化這些帶有親電中心的疏水化合物與還原型谷胱甘肽（GSH）的親核基團GS反應，中和它們的親電部位，使產物水溶性增加，經過一系列代謝過程，最后產物為巰基尿酸，被排出體外，從而達到解毒目的。另外，GST還能共價或非共價地與非底物配基以及多種疏水化合物結合，具有結合蛋白的解毒功能。,5,親和層析原理,有很多生物大分子與相應的分子間具有專一的可逆結合的特性，如酶與其底物、抑制劑、輔助因子，抗體與抗原，核酸與互補的堿基序列、核酸聚合酶、結合蛋白，激素與其受體、載體蛋白，細胞與其表面特異蛋白等等，它們依靠分子間的氫鍵、范德華力進行結合，這種專一的可逆結合力的稱為親和力。親和層析的方法就是根據(jù)具有親和力的生物分子間可逆地結合和解離的原理建立和發(fā)展起來的。,6,將一對能可逆結合和解離生物分子的一方作為配基，與具有大孔徑、親水性的固相載體相偶聯(lián)，制成專一的親和吸附劑，當被分離物隨著流動相經過親和吸附劑時，親和吸附劑上的配基就有選擇地吸附待分離物質，通過解吸附使待分離物質得以純化。親和層析的優(yōu)點：專一性結合，分辨率高，操作簡單，通過一次性操作即可得到較高純度的分離物質；具有濃縮作用，可以從含量很低的溶液中得到高濃度的樣品；利用生物學的特異性進行分離，所以分離條件比較溫和，能夠很好地保持樣品原有的生物學性質。,7,親和層析法分離生物大分子示意圖,8,9,親和層析介質的制備,配基的選擇：選擇合適的配基是親和層析中的重要環(huán)節(jié)，配基可以是有機小分子、生物大分子、染料等。根據(jù)待分離物質在溶液中與配基之間的親和力的大小和專一性等特性進行選擇，通過實驗來確定理想的配基。例如選擇酶的競爭性抑制劑、底物和輔助因子類配基可以純化酶，選擇互補的堿基序列、組蛋白、核酸聚合酶、核酸結合蛋白類配基可以純化核酸等等。在親和層析中，分離生物大分子的配基必須有適當?shù)幕瘜W基團能與活化基團發(fā)生偶聯(lián)作用，有較高的偶聯(lián)率，偶聯(lián)后配基和被分離生物大分子的專一結合特性不變，有效地分離目標產物；解吸附時不破壞生物大分子的生物活性和理化性質。,10,載體的選擇：親和層析的載體一般是凝膠類層析介質。一般比較理想的載體應具備稀松的多孔網狀結構，對于溶液具有良好的親水性、流動性和滲透性，大孔徑凝膠介質可以有效地使凝膠內部的羥基得到活化，以保證較高的活化效率，提高了配基的有效濃度，提供較高的親和容量；必須有足夠數(shù)量的化學基團，經化學方法活化后，可以與大量的配基相偶聯(lián)；具有良好的機械性能，保證親和柱維持較好的流速；必須是不溶于水、化學惰性的，非特異性吸附作用弱；有良好的物理和化學的穩(wěn)定性，在配基偶聯(lián)、親和層析、再生處理過程中不會因離子強度、溫度、pH的變化，變性劑、去污劑的應用而破壞載體的物理化學結構，在介質的反復使用過程中能抗微生物和酶的侵蝕。,11,瓊脂糖凝膠：目前應用最多的瓊脂糖凝膠是瑞典Pharmacia公司生產的Sepharose，它具有理想載體的特性。它是由D-半乳糖和3,6-脫水-L-半乳糖交替結合而成的大分子多聚糖，靠糖鏈之間的次級鍵交聯(lián)成的穩(wěn)定網狀結構的珠狀凝膠，網狀結構的疏密依靠改變瓊脂糖濃度的方法來控制。如Sepharose2B，4B和6B，其中阿拉伯數(shù)字表示凝膠中干膠的百分含量，機械強度隨凝膠濃度降低而減弱。目前廣泛使用Sepharose4B來分離生物大分子，本實驗采用的是本院自己研制的SepharoseQT4，相當于Sepharose4B。瓊脂糖凝膠的多聚合鏈不是由共價鍵連接而成的，在使用中應當注意的問題有受熱失去穩(wěn)定性，引起部分溶解，故不宜加熱消毒，低溫保存，凍結會破壞其結構，要避免在pH低于4高于9下長期工作，使用破壞氫鍵的試劑會降低凝膠的穩(wěn)定性，一般情況下不能進行干燥，適宜濕態(tài)保存。,12,常用活化劑：活化劑一般用溴化氰和環(huán)氧氯丙烷較多，二者各有利弊：(1)溴化氰：溴化氰活化載體是目前用得最多、效果最好的活化方法。活化效率高，速度快。缺點是溴化氰容易分解產生劇毒的氫氰酸及溴，活化臂短，不利于生物大分子的結合。(2)環(huán)氧氯丙烷：環(huán)氧氯丙烷活化效率高，活化臂較長，有利于生物大分子的結合。毒性很小，可以在常規(guī)條件下操作。缺點是活化溫度較高，4550，活化時間較長。,13,偶聯(lián)條件的選擇：(1)偶聯(lián)pH值：配基偶聯(lián)最佳pH在8-10之間最有效，在這個pH范圍內配基上的氨基多是非質子化形式，要盡可能地選用堿性條件。但是在高pH值時，可能會改變配基的高級結構，甚至喪失活性，所以在偶聯(lián)時pH的選擇要根據(jù)具體情況而定。(2)偶聯(lián)溫度和時間：溴化氰活化的載體，一般都在4左右偶聯(lián)過夜，也可以室溫（20-25）下反應2h。環(huán)氧氯丙烷活化的載體，一般在3545偶聯(lián)。偶聯(lián)時間要根據(jù)配基的濃度來確定，一般情況要1624小時。(3)偶聯(lián)配基的濃度：偶聯(lián)時并不總是需要大量的配基才能制成高效的親和吸附劑，高濃度配基的偶聯(lián)可以增加結合強度、空間位阻和非特異性結合，空間位阻可以引起親和吸附劑結合效率的降低，尤其是當高濃度大分子蛋白被偶聯(lián)時。對于多數(shù)親和吸附劑選用的配基濃度是1-20mol/mLgel，2mol/mL是最常用的配基使用量。,14,親和層析技術,吸附條件的選擇：純化生物大分子一般采用柱層析吸附法，根據(jù)親和吸附劑的吸附容量和待分離物質的總量選擇大小合適的層析柱。選擇吸附條件時要考慮平衡緩沖液的組成、pH范圍和離子強度，樣品上柱的體積、溫度和流速等因素，使親和介質與被分離物質具有較強的親和力。樣品溶液的pH和離子強度要與平衡緩沖液一致，一般接近中性。假如樣品中雜質多，純化對象與配基結合力弱時，可以控制樣品上柱的流速或重復過柱，以使純化對象與配基間充分起作用。樣品上柱后，用平衡緩沖液除去未吸附的雜蛋白，也可以用較高離子強度的鹽溶液進一步洗去非專一吸附的雜質，盡可能在親和柱上只留下專一吸附的結合物。,15,洗脫條件的選擇：親和層析的洗脫屬于特異性的解離方式，洗脫劑的選擇必須不引起待分離物的變性失活。洗脫劑多數(shù)采用改變層析條件如改變pH、離子強度或緩沖液組成的方法，使固定化配基和生物大分子之間的親和力降低，以致解開二者的結合。主要有幾種基本洗脫類型：(1)競爭性洗脫：特異的配基競爭性洗脫或底物競爭性洗脫，即在洗脫液中加入與親和吸附劑上相同或不同的配基，這些水溶性的配基和固定相配基相互競爭與大分子結合，由于前者游離的配基較高，結合力大大超過后者時，將被吸附的大分子洗脫下來。使用親和力更強的配基或底物洗脫效果更好。洗脫液中配基或底物的濃度要根據(jù)配基與結合物親和力的大小來決定。(2)離子強度洗脫：洗脫液離子強度增加有利于洗脫，可以是一步法或梯度變化，在強離子的作用下，使親和層析的結合力減弱，將被吸附物洗脫下來。增加鹽濃度可以使被吸附物解吸附，NaCl是最常用的鹽。,16,(3)pH離子強度洗脫：pH的變化改變結合位點上帶電基團的離子化程度，解吸附一般是降低pH，pH使用的限度要考慮載體、配基和被吸附物質的化學穩(wěn)定性。pH變化和離子強度雙重作用洗脫適合結合得比較牢的物質。(4)變性劑洗脫：有的蛋白質在親和介質上結合得比較牢固，在一定濃度的變性劑中有較好的穩(wěn)定性，這樣可以在洗脫液中加入變性劑，如鹽酸胍，尿素等，有利于蛋白質的解離。另外，親和介質多次使用后，柱效下降，用變性劑可以將吸附比較牢固的雜質洗凈，使親和介質再生。(5)化學斷裂：當一些蛋白質與親和吸附劑結合牢固，上述洗脫方法或用上述方法洗脫被吸附的大分子會發(fā)生不可逆失活時，可以采用專一的化學方法將配基和載體之間的連接鍵裂解，獲得配基蛋白質復合物。這個方法的缺點是親和吸附劑使用一次后，需要重新與配基偶聯(lián)后，才能再次使用。,17,洗脫方式：親和層析的洗脫方式，原則上與離子交換層析的洗脫方式相似，主要有以下三種方式：(1)一步洗脫：屬于非選擇性洗脫方法，應用于高度特異性吸附劑的結合，經過一次洗脫將被吸附物質全部洗脫下來，就可得到較純的分離物。非選擇性洗脫主要受洗脫液的pH、離子強度、溫度和介電常數(shù)等因素的影響，有效的洗脫液既能改變被吸附蛋白質的構象以降低蛋白質與配基之間的親和力，又不破壞蛋白質和親和吸附劑的穩(wěn)定性。(2)分步洗脫：屬于選擇性洗脫方法，應用于基團特異性吸附劑，親和吸附劑上吸附有特異性不盡相同的多組分樣品，用幾種不同的洗脫條件分幾步洗脫，可以將親和力大小不同的組分分開。(3)梯度洗脫：屬于選擇性洗脫方法，利用洗脫液的濃度梯度變化，即解吸附能力逐漸增強，對于吸附性質相同、特異性程度不同的酶和同工酶有效地洗脫。梯度洗脫比分步洗脫更有可能得到較純的分離對象。此方法需要有梯度混合儀來實現(xiàn)洗脫液的梯度變化。,18,影響親和層析的主要因素：(1)樣液體積的影響：在平衡條件下分離對象與固定化配基能緊密結合時，樣品溶液上柱時對體積要求不很嚴格，親和吸附劑的吸附總容量能被充分利用。與吸附劑結合力弱的樣品濃度要高，避免和非吸附物質一起流掉。(2)流速的影響：發(fā)生親和吸附時配基與生物大分子之間達到結合反應平衡是一個緩慢的過程，因此樣品上柱的流速應保證被結合物與配基之間有足夠的時間達到吸附平衡，尤其是弱的親和吸附劑。如果流速較快，樣品中蛋白質濃度又相對高時，往往有少量的待分離樣品和雜蛋白一起流出柱子，所以親和層析上柱樣品濃度大時，如組織勻漿液、腹水等，上柱前可將溶液適度稀釋，降低溶液的粘度并使親和吸附反應完全。洗脫時為得到尖銳的洗脫峰、被分離物最小的洗脫體積和最大的回收，一般采用低的洗脫速度。,19,(3)柱長的影響：多數(shù)情況下根據(jù)親和介質的吸附容量和待純化樣品的總量確定柱子的大小。如果親和介質的吸附容量高，可選擇較短的柱子，用較慢的線性流速，使待分離物質得以快速分離；如果親和吸附劑的親和性很低，選擇相對較長的柱子，保證待分離物與親和介質有充分接觸的時間，使二者較好地結合。(4)溫度的影響：溫度效應在親和層析中非常重要，親和介質的吸附強度隨溫度升高而減小。所以在親和層析中可以利用不同的溫度吸附和洗脫有利于蛋白質的親和純化，以得到親和層析最好的結果。一般選擇在4進行吸附，在不影響生物大分子活性的較高溫度下如25進行洗脫。,20,親和層析法分離GST的試劑,緩沖液A：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/L二硫蘇糖醇（DTT），1mmol/LEDTA，0.2mol/LNaCl緩沖液B：0.025mol/L磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含3mmol/LGSH，2mmol/LDTT注：根據(jù)酶的性質在分離純化過程中需要加入適量的金屬鰲合劑、還原劑等，以保持酶的活性。,21,親和層析法分離GST操作步驟,1.親和層析介質Sepharose4B-GSH的制備：Sepharose4B在堿性條件下，加入環(huán)氧氯丙烷和二氧六環(huán)活化，將GSH偶聯(lián)到載體上，制成專一吸附劑。2.親和層析柱的準備：裝柱，柱床體積約46mL（柱高約23cm），連接蛋白監(jiān)測系統(tǒng)，用BufferA平衡