.,藥學分子生物學,張徐江蘇大學醫學院分子生物學及檢驗教研室,xuzhang,.,生物芯片（biochip）,以生物、電子、機械和信息技術為基礎，在固相支持物表面建立集成、連續、微型分析系統，形成芯片，實現對生物大分子的準確、快速、高通量、自動化檢測。,.,基因芯片（genechip）,將大量探針有序排列于固相支持物表面或直接在固相支持物上原位合成探針，然后與標記的待測核酸樣品進行雜交，通過對探針雜交信號強度的分析來獲知樣品中相應靶分子的數量和序列信息。,.,基因芯片工作原理：核酸分子雜交,1.芯片的制備,基因芯片檢測步驟：,2.樣品準備和標記,3.分子雜交,4.信號檢測,5.數據處理分析,.,蛋白質芯片（proteinchip）,將蛋白質有序固定于載體上制備芯片，然后用標記的蛋白質或其他成分與芯片作用，洗去未結合的成分，再檢測芯片上的熒光強度，來分析蛋白質間或蛋白質與其他分子之間的相互作用關系。,.,將不同生物體組織標本按預先設計的順序排列在固相載體上形成的組織微陣列，是一種高通量、多樣本的分析工具。,組織芯片（tissuemicroarray）,.,用人工方法測定并分析核酸的堿基組成及排列順序，即測定核酸的一級結構。第一代測序技術：鏈末端終止法(Sanger法，雙脫氧鏈終止法),核酸測序（sequencingofnucleicacids）,.,雙脫氧鏈終止法測序,以待測單鏈DNA為模板，以dNTP為底物，在測序引物引導下，DNA聚合酶介導體外合成互補DNA。雙脫氧核苷三磷酸（dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP）為鏈終止子（4組1套反應），合成四組有序列梯度的互補DNA。高分辨電泳分離新合成DNA，根據產物大小識讀堿基排列順序，最終轉換為待測模板的核酸序列。,基本原理,.,雙脫氧核苷三磷酸(dideoxyribonucleosidetriphosphate,ddNTP),.,測序模板序列,5TCAGCTCGAATC,.,第六章常用分子生物學技術,第一節聚合酶鏈反應第二節分子雜交技術第三節基因敲除技術第四節RNA干擾技術第五節基因組編輯技術第六節分子相互作用技術,.,RNA干擾技術,雙鏈RNA能高效、特異性地誘導同源mRNA降解，從而沉默基因表達，稱為RNA干擾（RNAinterference,RNAi），也稱轉錄后基因沉默。,1990年，在轉基因牽牛花中觀察到共抑制現象,.,RNA干擾（RNAinterference,RNAi）,1998年，AndrewFire和CraigMelo首次將正義鏈和反義鏈RNA混合后，注入線蟲（C.elegans），觀察到更強的基因表達抑制作用，據此提出RNA干擾的概念。,A.未染色組;B.正常對照組C.反義RNA組;D.正義+反義RNA組,.,2001年，首次報道在哺乳動物細胞中，通過21個核苷酸大小的siRNA誘導特異性基因沉默。,.,安德魯菲爾&克雷格梅洛發現“RNA干擾機制”，獲2006年諾貝爾醫學獎,.,RNA干擾的機制,（1）siRNA形成：dsRNA被Dicer酶剪切成小干擾RNA（smallinterferingRNA，siRNA）（2）RNA誘導的沉默復合物（RNA-inducedsilencingcomplex，RISC）形成（3）RISC活化：siRNA解旋成為單鏈，無活性的RISC轉變成活性形式（包含siRNA反義鏈）（4）誘導靶mRNA降解：在siRNA反義鏈引導下，RISC識別并切割與siRNA反義鏈互補的靶mRNA（5）dsRNA的再生成,.,RNA干擾的機制,.,siRNA（小干擾RNA）：21-23nt，由dsRNA裂解而成的小片段，可誘導mRNA降解。siRNA主要參與抵御外源性病毒核酸的侵染。,RNA干擾（RNAinterference,RNAi）,miRNA（微小RNA）：約22nt，由miRNA前體剪切而成，可抑制mRNA翻譯。miRNA主要參與內源性基因表達調節。,.,.,.,RNA干擾技術實施策略,1、體外合成siRNA,采用化學合成法來直接合成靶向目的基因的siRNA，再通過不同方法導入細胞。,2、siRNA表達載體介導,根據siRNA序列設計DNA片段，插入表達載體中，導入細胞，轉錄出shRNA，進一步切割形成siRNA。,.,體外合成siRNA,.,短發卡RNA（shRNA）,siRNA表達載體介導,正義鏈,反義鏈,-CUGAGGUCACCAUUAGAUG-,靶mRNA,.,RNA干擾技術特點,1、RNA干擾技術優點,（1）具有較高特異性（2）基因沉默效率較高,2、RNA干擾技術缺點,“脫靶效應”（off-targeteffects）,.,RNA干擾技術的應用,2、基因治療（基因失活性治療）,（1）病毒感染性疾病通過RNAi抑制RNA病毒復制,1、基因功能研究（功能失活策略）,（2）基因過表達引起的疾病（如腫瘤）siRNA藥物,“基因敲減（knockdown）”,.,.,基因打靶（genetargeting）,利用同源重組原理對細胞特定內源基因進行改造的技術。,.,.,基因敲除（geneknockout）：宿主基因組中特定功能基因的部分片段被同源的外源DNA片段替代，從而使靶基因失活。,基因敲入（geneknockin）：外源功能基因與宿主基因組中的同源序列進行同源重組，插入到基因組中，從而在細胞內獲得表達。,基因打靶（genetargeting）,.,基因敲除小鼠的產生,1.體外構建基因敲除載體：靶基因同源DNA序列+選擇性標記基因,2.將基因敲除載體導入ES細胞：顯微注射法、電穿孔法等,3.篩選、鑒定發生了同源重組的ES細胞：標記篩選法、分子鑒定法,4.將ES細胞導入胚胎，胚胎植入假孕雌鼠的子宮,5.小鼠交配傳代獲得特定的純合基因型子代小鼠,.,Lepr8基因敲除小鼠比野生型小鼠（WT）出現明顯體重增加現象,.,REG基因敲除鼠（下圖）出現脊椎彎曲等早衰現象,.,Gab1基因敲除導致小鼠缺血性血管新生、側枝循環建立出現缺陷（圖示上半部分），主要是由于血管內皮細胞管狀結構形成的信號調控通路出現障礙而引起的（圖示下半部分）。,.,酪氨酸酶基因敲除后，本來是黑色的小豬，變成了白色，表現出典型的白化病特征。,.,基因編輯（geneediting）,對目標基因進行“編輯”，實現對特定DNA片段的敲除、加入等。,CRISPR/Cas系統：由CRISPR基因座與其串聯的Cas基因組成，通過序列特異的RNA介導，切割降解DNA。,.,Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats(CRISPR)/Ca