探究Seipin基因與間充質干細胞成骨分化及成脂肪分化的關系,專 業 ：病理學與病理生理學研 究 生 ：陳宏志 指 導 老 師：龐麗娟 副教授 李 鋒 教 授,2014級研究生開題報告,匯報內容,研究背景 研究目的及意義研究內容方法和技術路線主要創新點已做的準備工作經費預算,研究背景,人類Seipin基因定位于染色體11q13,由Magre等在2001年通過定位克隆的方法從9個先天性全身脂肪營養不良(CGL)的家系中篩選出來。Seipin基因的無義突變與2型CGL密切相關，該患者缺失幾乎全部的脂肪組織。,研究背景：Seipin基因突變的表現,Seipin突變,全身脂肪缺失,肌肉增多,黑棘皮癥,雄激素過多,肝腫大及脂肪肝,食欲亢進,肌肉中脂質沉積,主要方面,代謝方面,生殖方面,激素水平,其他方面,高甘油三酯血癥,胰島素抵抗,糖尿病,瘦素、脂聯素降低,不育,Human Molecular Genetics,2015,Vol.24,No.15 4238-4249,WT,SKO,WT,SKO,WT,SKO,黑色箭頭所指為附睪脂肪墊，顯示SKO 動物的脂肪缺失；紅色箭頭所指位置為肝臟，顯示SKO 動物的肝臟增大、顏色發白，提示脂質沉積。,Journal of Chongqing Medical University 2013.Vol.38 No.1,兩種動物不同放大倍數下附睪、皮下脂肪形態,與WT 動物相比，SKO 動物脂肪細胞大小、形態不一，提示SKO 動物脂肪組織發育不良。,Journal of Chongqing Medical University 2013.Vol.38 No.1,研究背景,Discov Med,2010,研究背景,干細胞,成骨分化,成脂分化,骨細胞,脂肪細胞,相互制約,seipin,研究背景,此消彼長,充質干細胞,成骨細胞,脂肪細胞,體外誘導培養,相關文獻一,相關文獻二,相關文獻三,提出問題,間充質干細胞,前脂肪細胞,成熟脂肪細胞,骨細胞,成骨細胞,成脂分化,成骨分化,課題前期工作,1、檢測Seipin基因敲除鼠的基因型，純合子和野生型分組。2、Micro CT掃描Seipin基因敲除鼠脛骨近端干骺端，記錄整理骨密度、骨小梁寬度。,數據,數據,研究目的及意義,目的：了解Seipin基因敲除后，小鼠骨量的變化。探究Seipin 基因與間充質干細胞成骨分化及成脂肪分化的關系。,意義：對于seipin的研究有助于更好地認識脂肪新生、脂滴的 動態調節以及脂肪代謝與骨代謝之間的關系，也將為脂 肪營養不良和肥胖等代謝性疾病的治療提供新的思路。,研究對象及內容,研究對象：Seipin基因敲除鼠脛骨近端干骺端及長骨骨髓。研究內容：1.小鼠脛骨近端干骺端骨密度、骨小梁寬度。 2.小鼠骨髓間充質干細胞誘導成骨、成脂肪分 化，檢測并對比純合子、野生型分化情況。,實驗方法,1.Seipin基因敲除鼠，采用組織消化法，行DNA PCR擴增， 并采用凝膠電泳鑒定小鼠基因型。隨機選取純合子10只 和野生型10只。30天體重約7g-15g。2.分別在小鼠30天、60天、90天行活體Micro CT掃描，分 析并記錄各時間點脛骨近端干骺端骨密度和骨小梁寬度。,實驗方法,3.取小鼠長骨骨髓，分離提純骨髓間充質干細胞，利用流式 細胞術對表面抗原Sca-1、CD29、CD11b、CD45進行鑒定。 4.分別誘導其成骨分化和成脂肪分化，堿性磷酸酶染色、 茜素紅染色、油紅O染色觀察并記錄分化情況。,Seipin基因敲除鼠,基因型鑒定，分組,Micro CT掃描不同時間點（30天、60天、90天）活體小鼠骨密度和骨小梁寬度,取小鼠骨髓，分離提純骨髓干細胞,骨髓干細胞成脂誘導分化，觀察并記錄分化情況,Seipin基因與干細胞成脂、成骨分化的關系,骨髓干細胞成骨誘導分化，觀察并記錄分化情況,流式檢測免疫表型,技術路線圖,取小鼠骨髓，全骨髓貼壁培養及消化控制法，分離提純骨髓干細胞,骨髓干細胞成脂誘導分化，油紅O染色，觀察并記錄分化情況,Seipin基因與干細胞成脂、成骨分化的關系,骨髓干細胞成骨誘導分化，堿性磷酸酶染色、茜素紅染色，觀察并記錄分化情況,流式檢測免疫表型Sca-1、CD29、CD11b、CD45,技術路線圖,實驗前的準備工作,1.查閱相關文獻，撰寫了綜述。2.了解PCR，Micro CT，干細胞培養及誘導分化， 流式細胞檢測等技術。,主要創新點,首次進行Seipin基因敲除鼠Micro CT掃描，檢測Seipin基因敲除后，小鼠骨量的變化。探討Seipin基因與間充質干細胞成骨分化及成脂肪分化的關系