細胞培養基本技術,細胞培養的基本概念,傳代： 細胞在培養器皿中生長一定時間后，被分開接種到新的培養器皿中。 原代培養 取自體內新鮮組織并置于體外條件下生長的細胞在傳代之前稱為原代培養。,細胞培養：使用單個細胞懸液組織培養：使用組織塊（O.51立方毫米）或薄片（厚0.2 毫米）器官培養：使用器官原基或器官的一部分或整個器宮,原代培養細胞的生命歸宿,原代培養期傳代期衰退期,有限細胞系，無限細胞系 細胞系 cell line細胞株 cell strain,培養細胞的特性,培養細胞的生長方式貼附生長： 必須貼附于支持物表面才能生長。見于各種實體瘤細胞懸浮生長： 于懸浮狀態下即可生長，不需要貼附于支持物表面。見于各種造血系統腫瘤細胞,每代貼附生長細胞的生長過程,游離期貼壁期潛伏期對數生長期停止期（平臺期）,游離期： 細胞接種后在培養液中呈懸浮 狀態也稱懸浮期。此時細胞質回縮，胞體呈圓球形。 10分鐘一4小時,貼壁期： 細胞附著于底物上，游離期 結束。細胞株平均在10分鐘一4小時貼壁。 底物：膠原、玻璃、塑料、其它細胞等 血清中有促使細胞貼壁的冷析球蛋白和纖粘素、膠原等糖蛋白（生長基質），這些帶正電荷的糖蛋白的促貼壁因子先吸附于底物上，懸浮細胞再與吸附有促貼壁因子的附著。進口塑料培養瓶涂有生長基質（化學合成的功能基團）,潛伏期 此時細胞有生長話動，而無細胞分裂。細胞株潛伏期一般為624小時。,對數生長期： 細胞數隨時間變化成倍增長，活力最佳，最適合進行實驗研究。,停止期（平臺期）： 細胞長滿瓶壁后，細胞雖有活力但不再分裂 機制：接觸抑制、密度依賴性,培養細胞生長的條件,1 細胞的營養需要2 細胞的生存環境 溫度: 37 O2 CO2: 5% CO2 +H2O H2CO3 H+ + HCO3- pH: 7.2-7.4 滲透壓 3 無污染 4 無毒,實驗準備,實驗用品：超凈工作臺，壓力蒸汽消毒器，電熱干燥箱，濾器，酸缸CO2培養箱倒置顯微鏡酶標儀、微孔板震蕩器液氮罐自動雙重純水蒸餾器，純水儀耗材：培養瓶，吸管，電動吸引器，培養板， 凍存管,壓力蒸汽消毒器：濕熱消毒，用途廣電熱干燥箱：干熱消毒（160 ，2小時）。主要用干玻璃器皿消毒 濾器：過濾除菌：大多數培養用液，如人工合成培養基、血清、 酶液等均采用濾過法除菌 超凈工作臺：為細胞操作提供無菌環境紫外燈 ：紫外線消毒。 主要用于培養室空氣、操作臺、塑料培養皿和培養板等表面消毒,超凈臺,超凈工作臺的工作原理是利用鼓風機驅動空氣遁過高效濾器除去空氣中的塵埃顆粒，使空氣得到凈化。凈化空氣徐徐通過工作臺面，使工作臺內構成無菌環境。,濾 器,CO2培養箱,CO2培養箱設定的條件為37 ，5CO2 。使用CO2培養箱培養細胞時應注意的問題： 用螺旋口瓶培養細胞時，需將瓶蓋微松，以保證通氣。 保持培養箱內空氣干凈。定期消毒（90 ，14 h)。箱內火菌蒸餾水3000毫升蒸餾水槽中以保持箱內濕度，避兔培養液蒸發。,自動雙重純水蒸餾器 純水儀,酶標儀 微孔板震蕩器,培 養 板,培養瓶,常用玻璃器皿清洗浸泡（自來水）、刷洗（洗衣粉）、酸泡（24小時）、流水沖洗、蒸溜水浸泡和沖洗、50烘干,清潔液的配制,2 細胞培養用液的配制水：新鮮配置的三蒸水或去離子水平衡鹽溶液：無Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS：NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml,消化液： 胰蛋白酶作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽健，除去細胞間粘蛋白及糖蛋白，影響細胞骨架，從而使細胞分離。 胰蛋白酶液濃度越高，作用越強，但超過一定限度會損傷細胞。 胰蛋白酶是一種黃白色粉末，用無Ca2+、Mg2+的PBS緩沖液配制常用的胰蛋白酶液濃度是0.25 。用濾器過濾除菌。胰蛋白酶液消化時間：2-10分鐘。用含血清培養液終止其對細胞的消化作用,培養基,培養基（培養液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養基和合成培養基。天然培養基：天然培養基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優點：營養成分豐富，培養效果好缺點：來源受限。 成分復雜，影響對某些實驗產物的提取和實驗結果的分析。 易發生支原體污染,合成培養基,合成培養基是根據細胞生存所需物質的種類和數量，用人工方法模擬合成的。目前已設計出許多種培養基，如TC199、MEM、RPMI-1640、 DMEM等。 合成培養基主要成分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質。 優點：標準化生產，組分和含量相對固定。 成本低 缺點： 缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。,人工合成培養基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養基（如血清）。,血清中含有：多種蛋白質（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子； 激素； 促貼附物質，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長因子轉移蛋白不明成分,一般說來含5小牛血清的培養基對大多數細胞可以維持細胞不死但支持細胞生長一般需加 10血清對于血清支持細因生長的生物學效應已得到證明，但對血清中的復雜成分至今尚未完全清楚血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養基中培養的細胞所反映的生物學特性是細胞和復雜血清因子的綜合反應。在生長因子、蛋白質工程、基因表達調控等研究領域，迫切需要用無血清培養基培養細胞,無血清培養基的主要研制策略：在基礎培養基中補充各種必需因子，如激素、生長因子 、結合蛋白 、貼壁和擴展因子 等。無血清培養基由基礎培養基和替代血清的補充成分組成。1975年，Sato首次成功地用無血清培養基培養了垂體細胞株，近20多年來已報道了幾十種細胞系在無血清培養基中成功地生長和增殖。無血清細胞培養基的使用保證了實驗結果的準確性、可重復性和穩定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產物的程序。,向無清培養液中能促進細胞系生長的補加物都是獨特的。適用于某種細胞株的培養液，很可能不適合另一種細胞株的生長。即使同源組織的不同細胞株，所需補加物也不同。 無血清培養基尚處于研究階段，難以推廣。 目前，絕大多數人工合成培養基使用時還需添加血清,血清質量好壞是實驗成敗的關鍵。常用血清有胎牛血潔、新生牛血清、小牛血情、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質量最好。優質血清的標準：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘血清的消毒：過濾除菌,抗菌素的使用： 在培養液配制后，培養液內常加適量抗菌素，以抑制可能存在的細菌的生長。 通常是青霉素和鏈霉素聯合使用。培養基內青霉素、鏈霉素最終使用濃度為每毫升100單位。 慶大霉素：每毫升100單位方便、廣譜、穩定,完全培養基的組成,基礎培養基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/L青、鏈霉素 各100卑位毫升,培養基的配制,RPMI-1640培養粉 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至 1000ml, 過濾除菌。 調節pH值至7.2 加血清（終濃度 10）,細胞傳代方法,根據細胞生長的恃點，傳代方法有3種。 1懸浮生長細胞傳代 離心法傳代：離心（1000轉/分）去上清，沉淀物加新培養液后再混勻傳代。 直接傳代法：懸浮細胞沉淀在瓶壁時，將上清培養液去除l2一23，然后用吸管直接吹打形成細胞懸液再傳代。 2 半懸浮生長細胞傳代（Hela細胞） 此類細胞部分呈現貼壁生長現象，但貼壁不牢，可用直接吹打法使紉胞從瓶壁脫落下來，進行傳代。 3貼壁生長細胞傳代 采用酶消化法傳代。常用的消化液有0.25的胰蛋白酶液。,貼壁生長細胞傳代方法：,1 吸光培養瓶中的培養液2 加入1-2 ml 0.25的胰蛋白酶液(以消化液能覆蓋整個瓶底為準）靜置2-10 min（顯微鏡下動態監測）。3 吸去胰蛋白酶液，加入培養液。4 用吸管吸取瓶內培養液，反復吹打瓶壁細胞，形成細胞懸液。5 吸取1/101/40細胞懸液，接種于新的培養瓶內。6 加適量新鮮培養液于接種了細胞懸液的新培養瓶內。7 將后者放入培養箱中培養。,細胞計數,血細胞計數器：手工計數細胞Coulter計數儀：人工計數,培養細胞活力測定,細胞活力測定是腫瘤體外研究中應用最廣的技術手段之一。任何培養瓶內生長的細胞都由死細胞和活細胞組成，從形態上區別死、活細胞是困難的。1 細胞克隆形成率實驗 單個細胞在體外增殖6代以上，其后代所組成的細胞群體形成肉眼可見的克隆。克隆形成卒用來表示細胞的增殖能力 克隆形成率比克隆形成數接種細胞數缺點：操作繁瑣優點：精確、可靠,2臺盼藍法,活細胞不被染色，死細胞染成藍色，用活細胞占細胞中的百分比表示細胞恬力 已淘汰,3 四唑鹽（MTT）比色法,四唑鹽（MTT）商品名為噻唑藍， 四吐鹽比色法的原理：活細胞中脫氫酶能將四唑鹽還原成不溶干水的藍紫色產物（formazan)，并沉淀在細胞中，而死細胞沒有這種功能。二甲亞砜（DMSO）能溶解沉積在細胞中藍紫色結晶物，溶液顏色深淺與所含的formazan量成正比。再用酶標儀測定OD值 MTT法簡單快速、準確，廣泛應用于新藥篩選、細胞毒牲試驗、腫瘤放射敏感性實驗等。,操作步驟 （1）單細胞懸液接種于96孔培養板；103-104細胞/孔，每孔培養基總量200微升（96孔培養板每孔容積370微升），37、5CO2培養箱中培養一段時間（根據實驗目的決定培養時間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續培養3小時。 （3）吸出孔內培養液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。 （4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長570納米）。記錄結果，繪制,操作步驟 （1）單細胞懸液接種于96孔培養板；103-104細胞/孔，每孔培養基總量200微升（96孔培養板每孔容積370微升），37、5CO2培養箱中培養一段時間（根據實驗目的決定培養時間） （2）加入2毫克毫升的MTT液（50微升孔）；繼續培養3小時。 （3）吸出孔內培養液后，加入DMSO液（150微升孔），將培養板置于微孔板扳蕩器上振蕩10分鐘，使結晶物溶解。 （4）酶標儀檢測各孔OD值（檢測波長為570 nm）。記錄結果，繪制細胞生長曲線,細胞凍存和復蘇,細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可以減少入力、經費，減少污染，減少細胞生物學特性變化。,凍存和復蘇的原則：慢凍快融,當細胞冷到零度以下，可以產生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質濃度升高，并在細胞內形成冰晶。 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞內不致產生大的冰晶；相反結晶就大，大結晶會造成細胞膜、綱胞器的損傷和破裂。復蘇過程應快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結晶。,慢凍程序,標準程序： 當溫度在-25 以上時， 12 /min 當溫度達-25 以下時， 510 /min 當溫度達-100時，可迅速放入液氮中 細胞凍存器簡易程序： 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。,低溫保護劑的應用,在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結過程，能使細胞內水分在凍結前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內冰晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。,細胞凍存方法,1預先配制凍存液： 含20%血清培養基 10%