,2016.11.19,G蛋白及其 受體的研究進展,講述步驟,01,GPCR的概念,2.由，三個不同亞基組成。激素與激素受體合誘導GTP跟G蛋白結合的GDP進行交換結果激活位于信號傳導途徑中下游的腺苷酸環化酶。3. G蛋白將細胞外的第一信使腎上腺素等激素和細胞內的腺苷酸環化酶催化的腺苷酸環化生成的第二信使cAMP聯系起來。具有內源GTP酶活性。,1. G蛋白是指能與鳥嘌呤核苷酸結合，具有GTP水解酶活性的一類信號轉導蛋白,是細胞信號傳導中的重要蛋白質,GPCR分類,1,2,3,其中亞單位在多數G蛋白中 都非常類似，分子量36kDa左右。亞單位分子量在8-11kDa之間，除Gt外，大多數G蛋白的亞單位都是相同的。,兩個亞單位的不同可以將蛋白分為Gs、Gi、Go、Gq、G12及Gt等六類。這些不同類型的G蛋白在信號傳遞過程各種發揮不同的作用,GPCRs的概念,02,1. G蛋白偶聯受體,是一大類膜蛋白受體的統稱。2.這類受體的共同點是其立體結構中都有七個跨膜螺旋，且其肽鏈的C端和連接第5和第6個跨膜螺旋的胞內環上都有G蛋白（鳥苷酸結合蛋白）的結合位點。3.目前為止，研究顯示G蛋白偶聯受體只見于真核生物之中，而 且參與了很多細胞信號轉導過程。,GPCRs的概念,GPCRs的結構與分類,03,GPCRs的結構,GPCRs的分類,04,GPCRGPCRs研究進展,GPCR被發現的歷史,Lefkowitz通過同位素標記的配體結合等實驗提出配體-受體-效應器相互作用的三級復合物模型。,Lefkowitz 2011年第一次在原子分辨率闡明了GPCR參與信號轉導的機制,3 GPCR工作機制研究,方法,隨后Lefkowitz實驗室克隆的GPCR,標記并分離純化擴散型配體的GPCR,諾貝爾獎得主,諾貝爾獎得主羅伯特萊夫科維茨,1,2,1,2,b2腎上腺素能受體,異丙腎上腺素,Lefkowitz,腎上腺素受體擴散型配體的GPCR的基因克隆,基于這一推論，Lefkowitz，Kobilka等人很快成功克隆了編碼人類b2腎上腺素受體蛋白的cDNA，編碼人類b1腎上腺素受體、人類血小板2腎上腺素受體、5-羥色胺受體以及第一個孤兒受體等在內的一系列受體的基因,工作中得到的信息和技術也幫助了嗅覺受體這一超家族的發現和克隆,諾貝爾獎得主布萊恩-科比爾卡,2001,2007,2007年，Kobilka利用T4溶菌酶融合蛋白方法解析了第一個非視紫紅質GPCR晶體結構：人beta2腎上腺素受體，他還獨立地通過抗體片段介導法解析了人beta2腎上腺素受體的結構。,GPCR工作機制研究,1.中國科學院生物物理所的王江云課題組和山東大學醫學院的孫金課題組于2015年9月8號在權威期刊Nature communications上發表了研究論文，報道了他們應用最新的非天然氨基酸編碼技術，揭示了G蛋白偶聯受體重要的信號轉導機制的詳細過程,研究GPCR,GPCRs的新發現,2. 研究 GPCRs 與 G 蛋白相互作用的傳統技術包 括免疫共沉淀、免疫共定位、GST 融合蛋白沉降等， 這些技術自身存在一定的不足，無法滿足在生理條 件下檢測受體或蛋白的相互作用。 而BRET、TIRF 及 FRET 等相關技術的出現解決了這一難題，它們 可以實時、動態、連續地監測生理狀態下受體-受體、 受體 -G 蛋白間的動力學關系，并且不會對細胞造 成損傷，這為受體與 G 蛋白相互作用的動力學研究 提供了更加便利、準確的研究手段。,研究GPCR,GPCRs的新發現,1,2,3,獲得第一 個人 GPCR 的精細結構，也是第 2 個 GPCR 的高 分辨率晶體結構，該結果被 Science 雜志評為 2007 年十大科技進展之一.,2008 年 5 月 Midori Murakami1 和 Tsutomu Kouyama 等報道了從烏賊視細胞中分離得到的 Rhodopsin 的精細結構，分辨率達 3.7 A，它與牛 Rhodopsin 結 構 基 本 相 似,主 要 區 別 在 于 牛 Rhodopsin 的 N 末 端 為 無 規 卷 曲 ， 而 烏 賊 Rhodopsin 的 N 末端形成了規則的 螺旋結構， 這可能與其生活的海洋環境有密切關系.,2008 年 7 月 Tony Warne 等采用缺失突變 的方法，將火雞 1 腎上腺素受體中不穩定的氨基 酸進行點突變，,同時將較長的 N 末端、C 末端以 及胞內 loop 進行缺失突變，降低其柔性，增加了 穩定性，最終獲得了該突變體 2.7 A的精細結構.,研究GPCR,GPCRs的新發現,1,2,1）膽酸鈉；2）飽和 劑量的受體拮抗劑 ZM241385；3） 膽固醇琥珀酸 單酯. 最終獲得了該突變體（A2A-T4L-C）與拮 抗劑 ZM241385 復合體 2.6 魡 的晶體結構，這也 是第二個人 GPCR 的高分辨率晶體結構.,除了上述兩個天然分離的 Rhodopsin 的結構 外，另外 3 個重組表達得到的 GPCR 晶體結構 （見表 ）也為我們提供了兩條可能獲得 GPCR 高 分辨率晶體結構的方法，即融合蛋白法和缺失突 變法.,盡管二者都對原始蛋白進行了結構改造， 這樣獲得的晶體結構可能會與其實際結構有一 定的差別，但也為我們更多了解該蛋白的結構與 功能關系提供了重要的參考.,1.近年來，有些學者還提出了另外一種可能獲 得高質量膜蛋白晶體的方法：盒式突變法. 即采 用漸進式的多位點突變技術，以親水殘基系統性 地替換 GPCR 蛋白跨膜螺旋表面的多個疏水殘