微生物的基本知識回顧 1 什么是微生物 微生物 microorganism microbe 是一類個體微小 結構簡單 肉眼不可見或看不清楚的微小生物的統稱 2 微生物的特點 個體微小 結構簡單 細胞大小以微米和納米計量 種類繁多 分布廣泛 一克沃土中含菌量高達幾億甚至幾十億生長繁殖快 代謝能力強 大腸桿菌 Escherichiacoli 在適宜的條件下 每20分鐘即繁殖一代 24小時即可繁殖72代 遺傳穩定性差 容易發生變異 自發突變頻率為10 6左右 細菌的性質 1菌體形態 球 桿 螺旋 革蘭氏染色 1884年丹麥醫師Gram所發明 真細菌根據細胞壁結構分為革蘭氏陽性菌 革蘭氏陰性菌 約40層網狀肽聚糖覆蓋在細胞表面 磷壁酸貫穿于肽聚糖層 形成厚約20 80nm的細胞壁 磷壁酸貫穿其中 革蘭氏陽性菌 G 細胞壁結構 內壁層 靠近細胞膜 為1 2層網狀肽聚糖 外壁層 脂多糖 LPS 磷脂層和脂蛋白層 革蘭氏陰性菌 G 細胞壁結構 脂多糖的結構模型 O 特異側鏈核心多糖類脂A 內毒素 熱源質 細菌的特出結構 芽孢 在其生長的一定階段在細胞內形成圓形或橢圓形 圓柱形休眠體結構稱為芽孢 功能 對惡劣環境有很強的抵抗能力 有的芽孢 在一定條件下可保持活力數年甚至數十年之久 它本身具有一個細胞維持生命的所有功能 特點 耐高溫 抗熱性很強 抗化學藥物和酸類 對溶菌酶有抗性 細菌的特出物質 熱原質 特點 耐高溫 不具揮發性 重要疏水原理 易被強酸 強堿破壞 可濾過性 易吸附性 可稀釋性 水溶性 內毒素 細胞壁外層 屬于細胞壁的組成部分 脂質A 一般與細胞結合在一起不分泌到環境中 只有當細菌溶解 裂解 后才釋放出來 故稱內毒素 少量內毒素0 001 g入血即可引起發熱反應 內毒素被吞噬細胞吞飲后 細胞釋放出內源性致熱原 經血流到達下丘腦 體溫調節中樞引起發熱 作用特點 沒有組織器官的選擇性肌體發熱 腹瀉 出血性休克或其他組織損傷不能經甲醛脫毒 2 菌落 colony 單個 或聚集在一起的一團 微生物在適宜的固體培養基表面或內部生長 繁殖到一定程度可以形成肉眼可見的 有一定形態結構的子細胞生長群體 菌落單位為CFU Colony FormingUnits 眾多菌落連成一片 菌苔 lawn 通常情況下 純培養能較好地被研究 利用和重復結果 因此 把特定的微生物從自然界混雜存在的狀態中分離 純化出來的純培養技術是微生物學研究的基礎 3細菌純培養的群體生長規律 把一定微生物接種到一定量的液體培養基中 在一定條件下進行一次性培養 定時取樣測定活菌數 以活菌數的對數值為縱坐標 以培養時間為橫坐標 就可以畫出一條有規律的曲線 這就是微生物的典型生長曲線 繁殖曲線 一般把典型生長曲線劃分為適應期 對數增長期 指數期 穩定期和衰亡期等四個時期 球菌 直徑 0 5 1mm桿菌 直徑 長度 0 2 1mm 1 5mm 青霉的分生孢子頭 根霉的孢子囊和孢囊孢子 酵母菌是對一類單細胞真菌的通稱 有球形 卵形 橢圓形 圓柱形等 大小在5 20 m 霉菌的細胞呈分枝或不分枝的絲狀 直徑約2 10 m 細菌菌落放線菌菌落霉菌菌落 酵母菌 2010年版中國藥典微生物檢驗主要增修訂內容 1 培養基的質量控制2 菌種的質量控制 1 微生物檢驗培養基質量控制技術 培養基是微生物試驗的基礎 直接影響微生物試驗結果 適宜的培養基制備方法 貯藏條件和質量控制試驗是提供優質培養基的保證 1 1培養基制備過程中的注意事項 1 1 1培養基的水化培養基水化時不得用銅鍋或鐵鍋 以防有離子混入培養基中 影響微生物的生長 配制培養基最常用的溶劑是純化水 不能含有任何可能抑制或影響微生物生長的物質 培養基制備過程中的注意事項 1 1 2培養基的溶解在培養基分裝滅菌前 各成分應溶解均勻 使用電爐等設備煮沸培養基時 應用小火加熱 并邊加熱邊攪拌 避免培養基焦化或爆沸溢出 培養基制備過程中的注意事項 1 1 3培養基的滅菌已配制好的培養基必須立即滅菌濕熱滅菌必須嚴格控制滅菌溫度和時間 培養基制備過程中的注意事項 1 1 4培養基的pH微生物必須在適宜的pH范圍內才能正常生長繁殖或體現其生物特性 調整培養基的pH 應用1mol LNaOH或1mol LHCl調整pH 一般滅菌前比最終pH高0 2 0 3 培養基制備過程中的注意事項 1 1 5培養基的保溫滅菌以后培養基應該迅速冷卻至所需溫度 避免長時間保存在滅菌鍋內 造成過度滅菌 影響培養基的營養成分或選擇性效果 1 2培養基質量控制 2010版藥典 培養基適用性檢查 計數培養基 控制菌檢查用培養基 1 2 1培養基適用性檢查的基礎 一 對照培養基系指按培養基處方特別制備 質量優良的培養基 用于培養基適用性檢查 由中國藥品生物制品檢定所研制及分發 二 定量質控菌株 BioBall BioBall是由生物梅里埃BTF公司生產的定量質控標準菌株 其水溶性球狀物包含了數量精確的微生物個體 主要用于培養基生長能力驗證 無菌控制 微生物限度檢查 抑菌效力檢查 陽性對照 方法驗證 能力驗證和MOU測定等試驗 廣泛用于制藥工業 食品工業 水及廢水檢測和其他相關行業的微生物質控 目前 BioBall有超過25種常用的檢測標準菌種 可提供SingleShot MultiShot 550 HighDose 10K和MultiShot 10E8四類系列產品 分別含有28 30cfu 標準誤差小于或等于3cfu 500 600cfu 8000 12000cfu和0 7 1 5x108cfu數量的孢子 芽孢或細胞 1 2 2計數培養基適用性檢查 大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉白色念珠菌 營養瓊脂培養基NutrientAgar NA 玫瑰紅鈉瓊脂培養基 酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基 YPD YeastPeptoneDextroseAgar 50 100CFU 1 2 2計數培養基適用性檢查 結果判定被檢培養基上的菌落平均數對照培養基上的菌落平均數菌落形態大小應與對照培養基上的菌落一致 70 菌落計數法證明培養基生長能力USP USP要求每批配制培養基作促生長能力測試菌種選擇 變化大 每個微生物單獨測試大豆酪蛋白消化培養基 金葡 銅綠 枯草沙堡葡萄糖培養基 白念 黑曲方法 在培養中加入少量中 不超過100cfu 的微生物 按要求培養 對于新鮮制備的菌液 生長與前批已通過測試的培養基的前次測試結果一致 標準 計數結果與標準接種物的計算量差別小于系數2 即計數結果在標準接種物數量的50 200 1 2 3控制菌檢查用培養基適用性檢查 促生長能力抑制能力指示能力 檢查項目 1 2 3控制菌檢查用培養基適用性檢查 促生長能力檢查 增菌培養基促生長能力檢查 分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養基和對照培養基中 在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養 與對照培養基管比較 被檢培養基管試驗菌應生長良好 培養基基本要求 1 2 3控制菌檢查用培養基適用性檢查 促生長能力檢查 固體培養基促生長能力檢查 取試驗菌各0 1ml 含菌數50 100cfu 分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上 在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養 被檢培養基與對照培養基生長的菌落大小形態特征應一致 培養基基本要求 USP控制菌檢查用固體培養基能力檢查 使用表面涂布法 在培養中加入少量中 不超過100cfu 的微生物 在規定溫度下培養不超過規定的最短時間 清楚的觀察到與前批已通過測試的培養基的前次測試結果一致 注 有生長就行 無數字上要求 1 2 3控制菌檢查用培養基適用性檢查 抑制能力檢查 培養基抑制能力檢查 接種不少于100cfu的試驗菌于被檢培養基中 在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最長時間下培養 試驗菌應不得生長 針對選擇性培養基 膽鹽乳糖培養基 膽鹽乳糖發酵培養基 四硫磺酸亮綠培養基 金黃色葡萄球菌 溴化十六烷基三甲胺瓊脂培養基 亞碲酸鹽肉湯培養基 卵黃氯化鈉瓊脂培養基 甘露醇氯化鈉瓊脂培養基 念珠菌顯色培養基 大腸埃希菌 1 2 3控制菌檢查用培養基適用性檢查 指示能力檢查 固體培養基指示能力檢查 取試驗菌各0 1ml 含菌數不大于100cfu 分別涂布于被檢培養基和對照培養基平板上 在相應控制菌檢查規定的培養溫度及時間下培養 被檢培養基中試驗菌生長的菌落形態 大小 指示劑反應情況等應與對照培養基一致 針對鑒別培養基 1 2 3控制菌檢查用培養基適用性檢查 指示能力檢查 液體培養基指示能力檢查 分別接種不大于100cfu的試驗菌于被檢培養基和對照培養基中 在相應控制菌檢查規定的培養溫度及最短培養時間下培養 與對照培養基管比較 被檢培養基管試驗菌生長情況 指示劑反應等應與對照培養基一致 針對鑒別培養基 典型特征 大腸桿菌在伊紅美藍瓊脂 EMB 曙紅亞甲藍 上典型特征 典型特征 黑曲霉和白色念珠菌在玫瑰紅鈉瓊脂RoseBengalAgar上典型特征 典型特征 金黃色葡萄球菌在甘露醇氯化鈉MannitolSaltAgar瓊脂上典型特征 典型特征 沙門氏菌在SS瓊脂上 沙門氏菌在BS瓊脂 亞硫酸鉍瓊脂 上 培養基質量控制 2010版藥典 實驗室配制的培養基的常規監控項目pH適用性檢查試驗定期的穩定性檢查以確定有效期 2 菌種的質量控制2 1概念 標準菌株 由國內或國際菌種保藏機構保藏的 遺傳學特性得到確認和保證并可追溯的菌株 標準儲備菌株 由標準菌株經一次傳代得到的培養物 商業派生菌株 由供應商提供的所有特性與標準菌株等效的菌株 代 將活的微生物接種到新鮮培養基中進行培養 并希望獲取新的微生物培養物 這種操作方式 新培養物對接種培養物而言就稱為一代 工作菌株 由標準儲備菌株經傳代得到的培養物 中國醫學菌種保藏中心提供的標準菌株 美國國家菌種保藏中心提供的標準菌株 法國生物梅里埃公司提供的商業派生菌株 Bioball 低溫冷凍保藏的標準儲備菌株 低溫蠟封保藏的標準儲備菌株 我所制備的工作菌株 中國藥典2010年版在方法的附錄中對菌種的規定同2005年版在新增的 藥品微生物實驗室規范指導原則 中對菌種有了較為明確的規定允許使用標準菌株和商業派生菌株標準菌株應按保藏機構提供的說明進行復活標準儲備菌株應進行純度和特性確認標準儲備菌株建議采用低溫冷凍干燥 液氮貯存或超低溫冷凍保藏的方法標準儲備菌株可用于制備每月或每周一次轉種的工作菌株冷凍菌株解凍后不得重新冷凍和再次使用工作菌株不可替代標準菌株 商業派生菌株僅可用作工作菌株 菌種鑒定簡單的講可以采用目前比較成熟的商品化鑒定技術 如API鑒定條基本程序為 對疑似菌種進行純培養進行染色鏡檢根據染色情況 并結合顯色培養基等鑒定的初步信息 選擇合適的鑒定條根據操作說明書 得到各生化反應的鑒定結果 通過查閱檢索表 得到菌種鑒定的初步結果也可以采用半自動或全自動的微生物鑒定系統 菌種的管理 菌種的采購菌種的復蘇菌種的傳代菌種的保藏菌種的使用和銷毀 菌種的采購每年年底 由實驗室菌種管理人員提出下一年度菌種采購的計劃 計劃購置的菌種一般為藥典收載的標準菌種 填寫請購單 經批準后 由所采購部門向指定的菌種保藏機構購置 所購菌種均為冷凍干燥菌種 采購部門購入菌種后 應及時移交實驗室 實驗室菌種管理人員應仔細核對菌種發放單和冷凍干燥菌種管標簽等各項信息 確認無誤后 置4 6 暫存 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的復蘇菌種在打開前應仔細核對標簽上菌名 菌號 并注意一株菌種使用一套打開用具 嚴防交叉污染 菌種復蘇應在生物安全柜內操作 大腸埃希菌 金黃色葡萄球菌 銅綠假單胞菌 沙門菌 生孢梭菌和白色念珠菌可同時接種液體培養基和瓊脂培養基斜面 枯草芽孢桿菌 短小芽孢桿菌 藤黃微球菌和黑曲霉可接種瓊脂培養基斜面 取瓊脂培養基斜面上的菌苔按要求對菌種的純度進行鑒定 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的傳代應在生物安全柜中進行菌種的傳代 取經過純度鑒定的第1代菌種管 瓊脂培養基斜面培養物 用于傳代制備第2代菌種 接種完畢 液體培養基或瓊脂培養基斜面應在規定的溫度下培養適宜的時間 芽孢桿菌宜培養5 6天 黑曲霉宜培養5 7天 其他菌種一般培養18 24小時 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的保藏保存的容器為無菌凍存管 保藏溫度為 70 在冷凍前 應貼上菌種標簽 標簽內容應包括菌名 菌號 傳代日期和有效期 所有凍存管應立即置低溫冰箱中 迅速冷凍 該方法保藏菌種的有效期規定為6個月 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 菌種的使用和銷毀本所保藏的菌種主要供本所檢驗工作使用并可對外提供給有關涉藥單位 本所提供的菌種為第二代低溫冷凍菌種 本所檢驗工作所需菌種 領用人應向菌種管理人員領取 并在 菌種領用記錄 上記錄菌名 數量 領用人等信息 外單位向我所購買菌種 應憑單位介紹信 并注明菌名 菌號 數量 必要時可預約購買 本所保藏的菌種 一般應每年更換原種 每年打開一套冷凍干燥菌種傳代制備第1代原種保存 過期菌種應及時銷毀 銷毀時應經121 20分鐘的生物滅活處理 浙江省食品藥品檢驗所菌種管理程序 通過制備工作菌種進行菌種保藏的方法優點操作簡便成本低比較容易掌握缺點保存期比較短反復傳代有引起變異的可能 通過制備標準儲備菌種進行菌種保藏的方法優點保存期較長反復傳代導致菌種變異的風險較小缺點操作相對復雜成本較高操作流程相對較長 受到污染的風險較高 菌種保藏方法舉例 申請號 專利號 200810124325本發明提供了一種菌種保藏方法 采用半固體 低溫密封培養的方法 將菌種接種于無菌的半固體培養基中 倒入無菌液體石蠟后豎直存放入 的環境溫度中保存 所述菌種為金黃色葡萄球菌 大腸埃希菌 銅綠假單胞菌 枯草芽孢桿菌 生孢梭菌 黑曲霉或白色鏈珠菌 具體過程為 制備半固體培養基 分裝 滅菌 然后培養 天 確定無菌后將菌種穿刺接種于半固體培養基中 平行于培養基平面穿刺接種不少于 點 倒入 高的無菌液體石蠟 用封口膜密封 豎直存放入 的電冰箱中保存 采用本發明可延長菌種的保存時間 同時菌種的濃度保持相對穩定 為生產 試驗節約了大量的成本 減少了菌種使用后廢棄物的處理和排放 減少了對環境的危害 斜面保藏法 一般使用營養瓊脂培養基 生孢梭菌使用液體硫乙醇酸鹽培養基 在30 35 培養18 24小時 存活時間1 3個月 斜面保藏的菌種在冰箱中放置應注意控制溫度 一般不宜低于4 也可以放置在室溫中 但應控制溫度不超過25 有關菌種的常見問題 陽性菌的制備 領取工作菌種 從斜面上取一定量的培養物 稀釋至系列梯度的菌懸液 分別測各梯度菌懸液的菌落數 臨用時 取相應稀釋菌懸液用于陽性試驗 同時用平皿法測定加入的菌液中的菌落數 是否可行 對照用菌液的制備應取工作菌種 接種置適宜的液體培養基中 經培養后獲得濃菌液 再進行稀釋和確定菌濃度 菌種傳代至第5代時 還能不能用該斜面菌種接種制備工作用菌液嚴格講 這種操作是不符合藥典規定的 藥典所指的傳代次數不超過5代 應該是指用于實驗的工作用菌液 因此 從保藏的角度看 制備成的斜面保藏菌種只能到第4代 陽性對照是否必須購買菌種 有效期一般為多長時間 對照用菌種應采用標準菌種 一般應外購有效期根據不同菌種 不同的保藏方法而異 如采用斜面移植保藏法 不能形成芽孢的細菌有效期一般為1個月 能形成芽孢的細菌有效期一般為3個月 真菌的有效期為3個月 如何對菌種進行復壯 傳代之前是否一定要做微生物學鑒定 確認是否有變異 復壯的方法應根據待復壯的菌種的保藏形式來確定 對凍干菌種 復壯操作較為繁瑣微生物傳代中的菌種確認是必須的 以短小芽孢桿菌為例說說細菌鑒定通過顯微鑒別 為不呈鏈狀排列的桿菌 革蘭氏染色為陽性 營養瓊脂斜面上菌苔光滑 薄 閃光 蔓延 不粘著 常常是淺黃色 生化試驗可選做明膠穿刺 淀粉水解和硝酸鹽還原 結果為明膠緩慢液化 淀粉水解陰性 硝酸鹽還原陰性 采用API鑒定條 結合染色鏡檢和接觸酶實驗等結果 微生物基本操作 1 純培養技術2 微生物的計數3 微生物形態的觀察4 微生物生理生化特性測定 干熱滅菌 160 180 2h 高壓蒸汽滅菌 濕熱滅菌 121 15 30min 試管 瓶子 培養皿等 常用的滅菌方法 常用的器具 一 純培養技術1 微生物培養的常用器具及其滅菌 無菌環境的保證 無菌室 萬及潔凈區凈化工作臺 萬及潔凈區下的局部百級酒精燈 外焰溫度最高 r 5cm的球形區為無菌區 1 無菌環境 微生物的環境器皿及培養基的無菌 操作者的外界環境及操作過程的無菌 環境及操作的無菌 2 無菌操作 火焰附近 酒精燈 煤氣燈 進行 2 接種 3分離純培養平板劃線法 streakplatemethod 2 劃線接種 分離純化 Inoculatinganagarplatetoobtainsinglecolonies 二 細菌 霉菌 酵母菌的計數 菌落總數的測定方法 活菌計數法 主要步驟為 將樣品制作成10倍梯度的稀釋液 選擇3個合適的稀釋度 吸取1mL于平皿 傾注培養基后 培養觀察 計數 對霉菌的計數 還可以采用顯微鏡直接鏡檢計數的方法 使用郝氏計測玻片 酵母菌的總數測定 可采用血球計數板進行顯微鏡直接鏡檢計數 酵母菌的死活鑒定可以通過0 1 的美蘭染液染色2 3min完成 活菌不著色 USP對菌落計數方法分析 菌落數的回收率可變范圍大 可能在 0 5log10單位左右 即真實值為A時 結果在100 5A A 100 5 100 5 3 16 菌落計數結果一般不均勻 其對數值 log10 近似正態分布 平皿技術的相對標準偏差 RSD 一般在15 35 與平皿上CFU的數量有關 可以用于評價實驗結果是否有效 或是藥典替代方法精密度判定標準之一 應用過程中的相關規定比較 與CP一致 固體培養基可計數范圍 通過牛奶中大腸埃希菌的計數 驗證 CP規定細菌 酵母菌 30 300CFUUSP推薦 25 250CFU不包括膜法對于黑曲霉建議 8 80CFU當加菌量過大時 加菌量越大回收率越低當加菌量極少時 加菌量越少誤差越大 CP2005菌數報告原則 1要求每片濾膜上的菌落數應不超過100個 2平皿法菌數報告規則宜選取細菌 酵母