蛋白質組學蛋白質組學相關技術及發(fā)展文獻綜述蛋白質組學相關技術及發(fā)展文獻綜述 張粒 植物學 21107016 1 概念及相關內容 1994年澳大利亞Macquaie大學的Wilkins和Williams等在意大利的一次科學會議上首次提出了蛋白質組proteome這個概念該英文詞匯由蛋白質的“prote”和基因組的“ome”拼接而成并且最初定義為“一個基因組所表達的蛋白質”1。然而這個定義并沒有考慮到蛋白質組是動態(tài)的而且產(chǎn)生蛋白的細胞、組織或生物體容易受它們所處環(huán)境的影響。目前認為蛋白質組是一個已知的細胞在某一特定時刻的包括所有亞型和修飾的全部蛋白質2。蛋白質組學就是從整體角度分析細胞內動態(tài)變化的蛋白質組成、表達水平與修飾狀態(tài)了解蛋白質之間的相互作用與聯(lián)系提示蛋白質的功能與細胞的活動規(guī)律。 2 蛋白質組學的分類 蛋白質組學從其研究目標方面可分為表達蛋白質組學和結構蛋白質組學。前者主要研 究細胞或組織在不同條件或狀態(tài)下蛋白質的表達和功能這將有助于識別各種特異蛋白3目前蛋白質組學的研究在這方面開展的最為廣泛其運用技術主要是雙相凝膠電泳Two-dimensional gel electrophoresis2DE技術以及圖像分析系統(tǒng) 當對感興趣的蛋白質進行分析時可能用到質譜。由于蛋白質發(fā)生修飾后其電泳特性將發(fā)生改變這些技術可以直接測定蛋白質的含量并有助于發(fā)現(xiàn)蛋白質翻譯后的修飾如糖基化和磷酸化等4 。 結構蛋白質組學的目標是識別蛋白質的結構并研究蛋白質間的相互作用。近年來酵母雙雜交系統(tǒng)是研究蛋白質相互作用時常用的方法同時研究者也將此方法不斷改進5。有研究者最近發(fā)現(xiàn)在研究蛋白質相互作用時通過純化蛋白復合物并用質譜進行識別是很有價值的4。 3 蛋白質組學相關技術 目前蛋白質組學研究在表達蛋白質組學方面的研究最為廣泛其分析通常有三個步驟第一步運用蛋白質分離技術分離樣品中的蛋白質第二步應用質譜技術或N末端測序鑒定分離到的蛋白質第三步應用生物信息學技術存儲、處理、比較獲得的數(shù)據(jù)。 3.1 蛋白質分離技術 這類技術主要是電泳其中應用最多的是雙向電泳技術其他還有SDS-PAGE、毛細吸管電泳等。除了電泳外還有液相色譜通常使用高效液相色譜HPLC和二維液相色譜2D-LC。 另外還有用于蛋白純化、除雜的層析技術、超離技術等。 3.1.1雙相凝膠電泳 雙相凝膠電泳two-dimensional gel electrophoresis2DE這是最經(jīng)典、最成熟的蛋白質組分離技術產(chǎn)生于20世紀70年代中葉但主要的技術進步如實驗的重復性、可操作性蛋白質的溶解性、特異性等是在近lO年取得的。它根據(jù)蛋白質不同的特點分兩相分離蛋白質。第一相是等電聚焦IEF電泳根據(jù)蛋白質等電點的不同進行分離。蛋白質是兩性分子根據(jù)其周圍環(huán)境pH可以帶正電荷、負電荷或靜電荷為零。等電點pI是蛋白質所帶靜電荷為零時的pH周圍pH小于其pI時蛋白質帶正電荷大于其pI時蛋白質帶負電荷。IEF時蛋白質處于一個pH梯度中在電場的作用下蛋白質將移向其靜電荷為零的點靜電荷為正的蛋白將移向負極靜電荷為負的將移向正極直到到達其等電點如果蛋白質在其等電點附近擴散那么它將帶上電荷重新移回等電點。這就是IEF的聚焦效應它可以在等電點附近濃集蛋白從而分離電荷差別極微的蛋白。 pH梯度的形成最初是在一個細的包含兩性電解質的聚丙烯酰胺凝膠管中進行。在電流的作用下兩性電解質可形成一個pH梯度。但由于兩性電解質形成的pH梯度不穩(wěn)定、易漂移、重復性差80年代以后研究人員研制了固定pH梯度的膠條IPG。此種膠條的形成需要一些能與丙烯酰胺單體結合的分子每個含有一種酸性或堿性緩沖基團。制作時將一種含有不同酸性基團的此分子溶液和一種含有不同堿性基團的此分子溶液混合兩種溶液中均含有丙烯酰胺單體和催化劑不同分子的濃度決定pH的范圍。聚合時丙烯酰胺成分與雙丙烯酰胺聚合形成聚丙烯酰胺凝膠。 第二相是SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳SDS-PAGE根據(jù)蛋白質的分子量不同進行分離。此相是在包含SDS的聚丙烯酰胺凝膠中進行。SDS是一種陰離子去污劑它能纏繞在多肽骨架上使蛋白質帶負電所帶電荷與蛋白質的分子量成正比在SDS聚丙烯酰胺凝膠中蛋白質分子量的對數(shù)與它在膠中移動的距離基本成線性關系。SDS-PAGE裝置有水平和垂直兩種形式垂直裝置可同時跑多塊膠如Amersham pharmacia Biotech的Ettan DALT II 系統(tǒng)可同時跑12塊膠提高了操作的平行性。 經(jīng)過2DE以后二維平面上每一個點一般代表了一種蛋白這樣成千種不同的蛋白即可被分離有關蛋白質的等電點、分子量及每種蛋白的數(shù)量信息也可以得到。 蛋白質組學分析對2DE后的染色技術要求很高除了標準的敏感性要求外還要求染色技術的線性和均一性6。目前有多種染色方法如考馬斯亮藍染色、銀染色、及熒光染色等。銀染比考馬斯亮藍染色靈敏度高已有學者對這兩種方法進行了比較如PhillipCash等在 檢測肺炎鏈球菌紅霉素敏感株和抵抗株表達的蛋白時用考馬斯亮藍G-250染色發(fā)現(xiàn)了200多種蛋白PI 4-7分子量15000-110000在相同的PI和分子量范圍下用銀染檢測到360多種蛋白7。但是銀染的線性效果并不是很好并且對質譜分析干擾大。考馬斯亮藍染色線性、均一性較高 對質譜干擾較小 但其敏感性較低。較理想的是熒光染色Thierrry Rabilloud等比較了兩種熒光劑RuBps和Sypro Ruby的效果發(fā)現(xiàn)其敏感性、線性都很好對質譜干擾小6但其成本較高。實驗時可以根據(jù)不同的目的選用不同的方法。 2DE圖像所產(chǎn)生的大量蛋白質點是單純用肉眼分析無法完成。目前有多種圖像分析軟件可用于膠的圖像分析如MelanieII BioRad PD Quest BioRad Phoretix 2D Full又稱2D Image Master Elite Amersham Pharmacia Biotech 等這些軟件可以完成蛋白質點的識別、匹配等具有很強的分析功能但其缺點是需要很多的圖像手工校對一般分析一個圖像需要8-10h。 2DE是目前唯一的一種能溶解大量蛋白質并進行定量的方法具有高通量、重復性好、敏感性較高等優(yōu)點8。它能同時分離和定量數(shù)千種甚至上萬種蛋白8。它的分辨率極高等電聚焦相可以區(qū)分PI相差0.1的蛋白質SDS-PAGE相可以區(qū)分分子量相差1kD的蛋白質9。 其缺點是由于蛋白表達水平的差異較大一些低豐度的蛋白不易檢測810。另外某些基因的表達產(chǎn)物在2D膠中呈多點或不同基因的表達產(chǎn)物共點使2D膠數(shù)據(jù)的比較、定量更加復雜8。2DE分離的蛋白數(shù)量受諸多因素影響疏水性的膜蛋白往往是藥物設計最好的靶點很難用此法分離同時染色技術的靈敏度和線性范圍不足以呈現(xiàn)所有分離的蛋白質。目前人們采用多種方法來減少這些缺點如通過增加上樣量分離低豐度蛋白應用窄范圍固定pH梯度膠條、蛋白層析等技術提高分離的蛋白數(shù)目應用熒光染色提高檢測靈敏度等。 3.1.2雙向熒光差異電泳 雙向熒光差異電泳twodimensional difference gel electrophoresis2DDlGE 2DDIGE分析系統(tǒng)是在傳統(tǒng)雙向電泳技術的基礎上結合了多重熒光分析的方法在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品并第一次引入了內標的概念極大地提高了結果的準確性、可靠性和重復性。在DIGE技術中每個蛋白點都有它自己的內標且軟件自動根據(jù)每個蛋白點的內標對其表達量進行校準這樣可以很好地去除樣品的假陽性差異點。DIGE技術可檢測到表達差異小于10的蛋白統(tǒng)計學可信度達到95以上。利用Ettan DIGE技術還可以對微量少到5g樣品進行蛋白質組學分析。2D-DIGE的具體操作過程與常規(guī)2DE的步驟相似所不同的就是在樣品制備時在每份樣品中預先分別加入不同的熒光染料并且需要制作一個供其他樣品比較的內參另外在電泳后的凝膠顯色時需要在特殊的熒光檢測 儀中進行。 3.1.3液相色譜 高效液相色譜因具有分離效率高、分析速度快、檢測靈敏度高和應用范圍廣等特點廣泛應用于生產(chǎn)實踐中。高效液相色譜是利用高壓輸液泵驅使帶有樣品的流動相通過裝填固定相的色譜柱利用固液相之間的分配機理對混合物樣品溶液進行分離的方法。例如對奶粉中三聚氰胺的檢測11。二維或多維液相色譜是將分離機理不同而又相互獨立的兩支色譜柱串聯(lián)起來構成的分離系統(tǒng)。樣品經(jīng)過第一維的色譜柱進入接口中通過濃縮、捕集或切割后被切換進入第二維色譜柱及檢測器。二維液相色譜通常采用兩種不同的分離機理分析樣品即利用樣品的不同特性把復雜混合物如肽分成單一組分這些特性包括分子尺寸、等電點、親水性、電荷、特殊分子間作用親和等。在一維分離系統(tǒng)中不能完全分離的組分可能在二維系統(tǒng)中得到更好的分離分離能力、分辨率得到極大的提高。完全正交的二維液相色譜峰容量是兩種一維分離模式單獨運行時峰容量的乘積。 3.2目的蛋白點的篩選 對目的蛋白的篩選通常與雙向電泳連用主要用來分析凝膠中分離出的蛋白質樣品采用的主要技術手段通常是Western印跡和差異蛋白比較分析。Western印跡主要是將雙向電泳后的凝膠不經(jīng)過染色而直接轉印到固相支持物如NC膜、PVDF膜等上再在膜上進行免疫學反應從而篩選出與免疫功能相關的蛋白差異蛋白比較分析則是先對凝膠進行染色然后應用軟件如Image Master、PDQuest等對存在差異的2組凝膠進行比較從而找出差異的蛋白。在比較時通常要求每個被分析的樣品重復3次然后先做組內比較再做組間比較。 3.3蛋白質鑒定技術 對2DE所產(chǎn)生的上千個蛋白用傳統(tǒng)的方法如Edman降解法等進行分析將是一個很艱巨的任務。質譜技術的發(fā)展解決了這一難題。 3.3.1一級質譜 質譜技術的高速發(fā)展目前可以快速、高效地對目的蛋白進行鑒定且樣品用量少通常達到微克級。除此之外質譜技術還可以對蛋白質翻譯后修飾進行分析。根據(jù)離子源的不同質譜主要包括基質輔助激光解析飛行時間質譜MALDITOFMS、電噴射離子井飛行時間質譜ESITOFMS。常用的質譜分析儀除了飛行時間TOF外還有四級桿Q、離子井而在串聯(lián)質譜中通常使用的是QTOF或TOFTOF等。 2種離子源都可以使肽段、蛋白、藥物的代謝產(chǎn)物、寡核苷酸等其他碳水化合物離子化進而被質譜儀分析。通常的質譜儀一般由樣品槽、離子源、分析儀和檢測器組成。 由于單一地依靠蛋白質相對分子質量并不能對目的蛋白進行理想的鑒定因此須事先用蛋白酶如胰蛋白酶將檢測樣品酶解成不同長度的肽段。在MALDITOF質譜中還需要向樣品中加入基質以促使樣品離子化離子化的確切基質目前還不清楚然后在離子源的作用激光激發(fā)下使樣品變?yōu)闅庀嚯x子。這些被激發(fā)的氣相離子進入質量分析儀根據(jù)其荷質比而把肽段進行區(qū)分。質譜的整個過程都是在真空條件下進行的。ESI則不需要基質輔助而是使用具有一定能量的電子直接作用于樣品分子使其電離。 3.3.2二級質譜 二級質譜同時將2個上述質譜連接在一起構成的串聯(lián)質譜可以更精確、更靈敏地分析蛋白樣品。二級質譜的使用使得質譜不僅可檢測肽段的相對分子質量還可以檢測它的氨基酸序列。利用質譜儀的第一個分析儀對蛋白樣品進行初步檢測從樣品混合中選擇特定的肽段再將這個特定的肽段與惰性氣體如氮氣、氬氣等碰撞從而將肽段進一步離解。在被選擇的肽段與惰性氣體發(fā)生能量碰撞時支持蛋白主鏈構象的化學鍵受到破壞碰撞后的結果再被第二級質譜分析儀分析。串聯(lián)質譜又叫碎片譜或MSMS譜。在二級質譜中可以將差別只有1個氨基酸的相鄰肽段區(qū)分開。因此通過分析臨近峰的相對分子質量可以檢測肽段的氨基酸序列舊。 3.3.3肽質量指紋圖譜 肽質量指紋圖譜peptide InasfingerprintingPMF 當被離子化的肽段經(jīng)過質譜儀時這些肽段因其相對分子質量的不同而被分離因此產(chǎn)生了含有不同峰值的肽質量指紋圖譜。蛋白質鑒定便是通過對PMF的分析實現(xiàn)的即將所得到的PMF與已知數(shù)據(jù)庫中一個蛋白的理論期望蛋白酶肽段進行比較可以得到一個匹配程度得分當這個得分高于理論計算的得分時便認為該蛋白是理論中的蛋白。這些已知數(shù)據(jù)庫在互聯(lián)網(wǎng)上有很多其中NCBI和EBI的數(shù)據(jù)庫是最大的而且是免費的。在搜索這些數(shù)據(jù)庫時需要使用搜索軟件如Mascot、PepSea、PeptideSearch等其中Mascot是最常用的軟件。最近開發(fā)了一個新的程序Paragon該程序克服了Mascot被動的、概率的、估計的搜索模式所帶來的缺點被認為是Mascot的替代者舊。 質譜技術能清楚地鑒定蛋白質并能準確地測量肽和蛋白質的分子量、氨基酸序列及翻譯后的修飾。目前MS/MS是唯一能夠迅速測序N末端封閉或共價修飾肽段的方法12。質譜技術很靈活能與多種蛋白分離、捕獲技術聯(lián)用對普通的緩沖液成分相對耐受12能快速鑒定大量蛋白質點而且很靈敏10在一些情況下僅需10-15 fmol的蛋白10139 這在只能得到極少量蛋白的情況下鑒別蛋白是很有用的。在實際工作中可將幾種技術結合應用如串聯(lián)質 譜與Edeman微測序技術相結合12MALDI質譜與納米電子噴射質譜相結合14這些技術相互互補為分析2DE所分離的大量蛋白質提供了有效的手段。 質譜技術是一項強大的分離分析技術但它只能分離氣體狀態(tài)的帶電分子而且一次只能分析帶正電或帶負電的分析物。質譜分析很難區(qū)分兩種同源性極高的蛋白。由于質譜分析只是描述蛋白的少量多肽因此可能把刪節(jié)的蛋白當成是原來的蛋白。通常只適用于象酵母等基因組序列已知的個體。 3.4酵母雙雜交技術 酵母雙雜交系統(tǒng)的建立得力于對真核生物調控轉錄起始過程的認識。細胞起始基因轉錄需要有反式轉錄激活因子的參與。轉錄激活因子在結構上是組件式的modular 即這些因子往往由兩個或兩個以上相互獨立的結構域構成 其中有DNA結合結構域DNA binding domain 簡稱為DB和轉錄激活結構域activation domain 簡稱為AD 它們是轉錄激活因子發(fā)揮功能所必需的。 單獨的DB雖然能和啟動子結合 但是不能激活轉錄而不同轉錄激活因子的DB和AD形成的雜合蛋白具有激活轉錄的功能。DB與AB分別能與多肽X和Y結合由DB和AD形成的融合蛋白現(xiàn)在一般分別稱之為“誘餌”bait和“獵物”或靶蛋白prey or target protein。 如果在X和Y之間存在相互作用 那么分別位于這兩個融合蛋白上的DB和AD就能形成有活性的轉錄激活因子 從而激活相應基因的轉錄與表達。這個被激活的、能顯示“誘餌”和“獵物”相互作用的基因稱之為報道基因reporter gene。 通過對報道基因表達產(chǎn)物的檢測 反過來可判別作為“誘餌”和“獵物”的兩個蛋白質之間是否存在相互作用15。用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測蛋白質之間的相互作用通常會存在假陽性或假陰性的問題已有許多學者對此系統(tǒng)進行了改進并且將其擴展到檢測DNA-蛋白質RNA-蛋白質小分子-蛋白質之間的相互作用上16。 3.5蛋白質樣品的生物信息學分析 分子生物學的發(fā)展把生命活動的物質基礎追溯到核酸和蛋白質兩大類生物大分子它們構成了生物數(shù)據(jù)的主要部分。關于這些生物大分子的結構、相互作用和功能的研究也產(chǎn)生著大量數(shù)據(jù)。 3.5.1蛋白功能的預測 蛋白功能的預測可以通過3條途徑實現(xiàn)。首先通過與已知蛋白質序列相比較來檢測蛋白的功能。此外蛋白質的一些其他性質可以直接由序列分析得到。比較常用的蛋白質序列數(shù)據(jù)庫是SwissProt、P1R和NCBI的Blast其次可以通過蛋白質的物理性質的預測。蛋白質 的一些功能特征可以通過蛋白序列直接推算出來通過組成蛋白質的20種氨基酸的物理和化學性質分析已知或未知蛋白質的性質如等電點相對分子質量、疏水性、跨膜螺旋、卷曲螺旋及信號肽等。除了上述2種方法外還可以與保守的基序和圖形數(shù)據(jù)庫比較判斷功能。對于那些與數(shù)據(jù)庫中已知功能蛋白質無同源性的序列或找到同源性的蛋白質功能為未知時我們可與保守的基序比較來判斷其功能。基序數(shù)據(jù)庫中最為常用的是網(wǎng)站Prosite。 3.5.2蛋白結構的預測 雖然有時蛋白質的序列相似但是卻執(zhí)行著不同的功能或同源基因編碼的蛋白質雖然序列差別很大但是對于生物體來說執(zhí)行的卻是同樣的功能。這主要是因為蛋白質的空間結構發(fā)揮了作用。在PDB等數(shù)據(jù)庫中可以檢索到一些蛋白質高級結構的同源性。蛋白質二級結構預測的基本依據(jù)是每一段相鄰的氨基酸殘基具有形成一定二級結構的傾向。因此進行二級結構預測需要通過統(tǒng)計和分析發(fā)現(xiàn)這些傾向或者規(guī)律。蛋白質二級結構預測的方法有3種。一是由已知結構統(tǒng)計各種氨基酸殘基形成二級結構的構象趨勢其中最常用的是Chou和Fasman法二是基于氨基酸的物理化學性質包括堆積性、疏水性、電荷性、氫鍵形成能力等三是通過序列比對由已知三維結構的同源蛋白推斷未知蛋白的二級結構。一般對于螺旋預測精度較好對折疊差些而對除螺旋和折疊等之外的無規(guī)則二級結構則效果很差。蛋白質三維結構的預測是最復雜和最困難的預測技術。序列差異較大的蛋白質序列也可能折疊成類似的三維構象。由于蛋白質的折疊過程并不十分清晰從理論上解決蛋白質折疊的問題還有待進一步的科學發(fā)展但也有一些有一定作用的三維結構預測方法如與已知結構的序列比較、同源模建、threading算法和折疊識別方法。 盡管生物信息學發(fā)展迅猛但是它仍然不能承載所有的研究信息。雖然通過在生物數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站內檢索可以得到一定的分析結果但這個分析結果可能并不完整比如細菌中的有些蛋白不僅對于機體來說發(fā)揮正常代謝的功能而且該蛋白還具有一定的致病性而后者基本上無法通過生物信息學網(wǎng)站分析得到這就需要閱讀大量的文獻以獲得更完整的信息。 4 蛋白質組學的應用 蛋白質組學的應用為醫(yī)學、生命科學等研究領域提供了新的思路并且?guī)砹溯^為豐碩的結果。目前在原核生物、真核生物以及多細胞生物體研究中都有廣泛應用。如對霍亂弧菌17以及大腸桿菌18在不同酸堿條件下蛋白表達的變化的研究表明這些病原菌會隨環(huán)境的改變而調節(jié)蛋白表達以使其達到最大的致病能力。在真核生物研究方面Michel Perrot等用2DE及質譜、免疫雜交、微量測序等方法分離和鑒定了釀酒酵母的401種蛋白309種以 前曾報道過剩余的92種是新發(fā)現(xiàn)的從而拓展了酵母參考圖譜為研究細胞功能、酵母翻譯因子靶點提供了條件10。應用蛋白質組學技術還可能實現(xiàn)癌癥的早期診斷120l。在致病微生物方面同樣碩果累累。蛋白質組學的應用可以實現(xiàn)高通量、高效率地對樣品進行分析并可以同時得到多個重要的研究結果。 5 存在的不足 盡管蛋白質組學應用前景廣闊、研究成果豐碩但仍然存在許多不足。如2DE的靈敏度雖然已達fmol水平但仍難將細胞組織內多種痕量調控蛋白分離顯示出來而此類蛋白對于基礎與應用研究都極為重要甚至比高含量結構蛋白更為重要。此外現(xiàn)有質譜技術雖然在蛋白質組成分的鑒定中高效、靈敏、特異但儀器價格十分昂貴因此技術推廣受到很大的限制。還有現(xiàn)今的蛋白質組研究仍局限于對已完成基因組計劃的理論預測的蛋白質組進行實證分析閉。未來的蛋白質組學應該擺脫基因組學的束縛在真正意義上實現(xiàn)蛋白質的體外合成、體外加工與修飾以及簡單方便的蛋白測序與鑒定等。 6 展望 目前有約60種微