庖丁巧解牛知識巧學 一、凝膠色譜法凝膠色譜法是根據相對分子質量的大小分離蛋白質的有效方法。當一個含有各種分子的樣品溶液緩慢通過凝膠時，相對分子質量大的蛋白質分子不能進入凝膠顆粒內部，通過的路程短，移動速度快；相對分子質量小的蛋白質分子比較容易進入凝膠內的通道，通過的路程長，移動速度慢。因此，樣品中相對分子質量大的蛋白質先流出，相對分子質量小的分子后流出。二、緩沖溶液緩沖溶液能夠抵制外界加入少量酸和堿的影響，仍能維持溶液pH基本不變。該溶液的這種抗pH變化的作用稱為緩沖作用。緩沖溶液通常是由一或兩種化合物溶于溶劑（即純水）所得的溶液，溶液內所溶解的溶質（化合物）稱之為緩沖劑，調節緩沖劑的配比即可制得在不同pH范圍內使用的緩沖液。知識拓展 緩沖溶液由足夠濃度的酸堿對組成。其中，能對抗外來強堿的稱為共軛酸，能對抗外來強酸的稱為共軛堿，這一對共軛酸堿通常稱為緩沖對、緩沖劑或緩沖系，常見的緩沖對主要有三種類型：弱酸及其對應的鹽；多元弱酸的酸式鹽及其對應的次級鹽；弱堿及其對應的鹽。三、電泳電泳是指帶電粒子在電場的作用下發生遷移的過程。許多重要的生物大分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可解離基團，它們在某個特定的pH下會帶上正電或負電；在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷相反的電極方向移動。電泳技術就是在電場的作用下，利用待分離樣品中各種分子帶電性質以及分子本身大小、形狀等性質的差異，使帶電分子產生不同的遷移速度，從而達到對樣品進行分離、鑒定或提純的目的的。要點提示 電泳分離方法主要就是根據大分子的分子量及電性差異將大分子在電場中彼此分來的。簡單地說，這些帶電粒子在電泳時的遷移率，與粒子所帶的電荷量成正比，與分子量大小成反比。四、實驗操作：蛋白質的提取和分離1.樣品處理（1）紅細胞的洗滌洗滌紅細胞的目的是去除雜蛋白。采用低速短時間離心，吸出上層透明的黃色液體，再加入五倍體積的生理鹽水，重復洗滌三次，直至上清液中沒有黃色，表明紅細胞已洗滌干凈。要點提示 洗滌次數過少，無法去除血漿蛋白；離心速度過高和時間過高會使白細胞和淋巴細胞一同沉淀，達不到分離的效果。（2）血紅蛋白的釋放紅細胞在蒸餾水和40%的甲苯作用下破裂，釋放血紅蛋白。（3）分離血紅蛋白溶液將混合液進行離心后會分層，第3層的紅色透明液體是血紅蛋白。（4）透析目的是除去樣品中的分子量較小的雜質。2.凝膠色譜操作（1）凝膠色譜柱的制作（2）凝膠色譜柱的裝填裝填前，凝膠用蒸餾水或者洗脫液充分溶脹。凝膠裝填要均勻，色譜柱內不能有氣泡，一旦發現有，必須重裝。裝填完后，立即用300 ml 20 mmol/L的磷酸緩沖液充分洗滌平衡凝膠12 h，使凝膠裝填緊密。（3）樣品的加入和洗脫按正確方法加樣，不能破壞凝膠面。進行洗脫時，等紅色的蛋白質接近色譜柱底端時，采用試管收集。方法點撥 血紅蛋白提取和分離的程序可分為四大步包括：樣品處理、粗分離、純化和純度鑒定。首先通過洗滌和紅細胞、血紅蛋白的釋放、離心等操作收集到血紅蛋白溶液，即樣品處理；再經過透析去除分子量較小的雜質，即樣品的粗分離；然后通過凝膠色譜法將相對分子質量大的雜質蛋白除去，即樣品的純化；最后經聚丙烯酰胺凝膠電泳進行純度鑒定。疑點突破 血紅蛋白的分離是否成功如果凝膠色譜柱裝填得很成功、分離操作也正確的話，能清楚地看到血紅蛋白的紅色區帶均勻、狹窄、平整，隨著洗脫液緩慢流出；如果紅色區帶歪曲、散亂、變寬，說明分離的效果不好，這與凝膠色譜柱的裝填有關。3.SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(選做)SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳測定蛋白質分子量,是根據大多數蛋白質都能與陽離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)按重量比結合成復合物,使蛋白質分子所帶的負電荷遠遠超過天然蛋白質分子的負電荷，消除了不同蛋白質分子的電荷效應,使蛋白質分子相對遷移率的大小完全取決于分子量的高低，因此可從已知分子量的標準蛋白質的對數和相對遷移率所作的標準曲線中求出供試品的分子量。問題探究 問題1 凝膠色譜柱的裝填應注意哪些事項？思路:凝膠色譜柱的高度、平整程度以及均勻與否都可能會影響樣品的分離度。探究:（1）裝填前為了加速膨脹，可以加入洗脫液的濕凝膠用沸水浴加熱，優點是：節約時間，除去凝膠中可能帶有的微生物，排除膠粒內空氣。（2）裝填時不能有氣泡，氣泡會攪亂洗脫液中蛋白質的洗脫次序，降低分離效果。（3）裝填后不能發生洗脫液流干，露出凝膠顆粒的現象。問題2 蛋白質是如何分離的？思路:蛋白質是根據離心原理分離的。探究:當含有細小顆粒的懸浮液靜置不動時，由于重力場的作用，使得懸浮的顆粒逐漸下沉。粒子越重，下沉越快，反之密度比液體小的粒子就會上浮。微粒在重力場下移動的速度與微粒的大小、形態和密度有關，并且又與重力場的強度及液體的粘度有關。象紅血球大小的顆粒，直徑為數微米，就可以在通常重力作用下觀察到它們的沉降過程。典題熱題例1下列關于凝膠色譜法的原理及操作不正確的是（）A.是利用凝膠把分子大小不同的物質分離開的一種方法B.在洗脫過程中，大分子不能進入凝膠內部而最先流出，而小分子可以進入凝膠內部而流速緩慢，以致最后流出C.凝膠內部有很微細的多孔網狀結構，其孔隙大小與被分離的物質分子的大小無相應關系D.一般情況下，凝膠對要分離的物質沒有吸附作用，因此所有要分離的物質都應該被洗脫出來。解析：本題考查凝膠色譜法分離蛋白質的原理。凝膠色譜法是根據相對分子質量大小分離蛋白質的有效方法，凝膠是由多糖類化合物構成的，其內部有很微細的多孔網狀結構，小分子蛋白質可以進入凝膠內部，路程較長，移動速度慢，而相對分子質量較大的蛋白質無法進入凝膠內部，路程較短，移動速度快，因此在洗脫過程中分離。選用不同種凝膠，其立體網狀結構不同，孔隙大小不同，因此可分離的分子大小也不同，故應相關。凝膠一般對分離的物質無吸附作用，所有要分離的物質都應該被洗脫出來。這是凝膠色譜法與一般層析法的不同。答案：C例2電泳技術可分離和解析氨基酸和核苷酸等有機物，下圖是把含有21個氨基酸的多肽進行水解，將氨基酸混合物進行電泳的結果。據圖分析該多肽由幾種氨基酸組成（）A.6 B.4C.5 D.3解析：電泳分離方法主要就是