Chapter 6、細胞拆合與克隆技術,61 細胞拆合 611 細胞拆合技術發展概況 612 細胞拆合概念與意義 613 細胞拆合技術與關鍵 62 克隆技術 621 克隆的定義及理論基礎 622 細胞核移植（也是克隆技術關鍵） 623 克隆動物一般制備技術 624 體細胞克隆技術 625 克隆技術的應用與意義 626 存在的問題 627 克隆技術發展趨勢,61 細胞拆合,611 細胞拆合技術發展概況,612 細胞拆合概念與意義,一、細胞拆合（Cell Reconstruction）： 是指從活細胞中分離出細胞器及其細胞組 分，在體外一定條件下將不同細胞來源的 細胞器及其組分進行重組形成有生物活性 的細胞或細胞器的一種細胞工程技術。,二、細胞拆合過程： 細胞器及其分離 同種或異種細胞器與 組分重組 新的重組細胞或新的性狀或產品 細胞核分離、 細胞核 胞質體的獲得 融合 胞質體,三、細胞拆合基本方式（目前）,四、細胞拆合意義,細胞拆合技術是現代生物工程中令人 矚目的熱點課題，細胞拆合與細胞融合 技術是細胞工程中的細胞或細胞器水平 上主要構建手段，它與基因轉移技術、 干細胞技術等結合，可以人為地獲得新 物種或使細胞表達新的性狀和新的產物。,613 細胞拆合技術與關鍵,一、細胞拆合技術方法 細胞組分分離技術 分級分離法 細胞大小、密度 密度梯度離心法 利用 細胞表面電荷 流式細胞分選儀分離法 細胞表面標志,細胞破碎方法,超聲波破碎法 反復凍融法：-70 37C，重復3-4次， 細胞壁破碎 化學裂解法：SDS（十二烷基磺酸鈉） 高速組織搗碎法：需循環水冷卻,流式細胞分選儀,去核細胞（胞質體）的制備：（見羅立新表5-1）,核體的制備： 貼壁法純化（見圖5-2、5-3） 核體需5-10h再貼壁 培養 分離 完整細胞需2h （菲可液梯度離心）,微核體的制備： CB具有排核作用，形成的微核體； 01ug/mL秋水仙胺，48h，處理細胞 細胞微核化 離心14000r/min、20min， 80-90% 1-3%牛血清密度梯度離心 （見圖5-4）, 去核細胞的性質：,二、細胞拆合技術關鍵,細胞器與完整細胞融合： ctDNA葉綠體 （抗藥性、色素） 細胞器分離 細胞器包裹 mtDNA線粒體 形成脂質體或血影細胞 與完整細胞融合 生物大分子引入完整細胞： 1975年，童第周、牛滿江，鯉魚或鯽魚mRNA 鯉金魚 金魚受精卵 鯽金魚,62克隆技術,621 克隆的定義及理論基礎 一、克隆（clone）： 克隆原意為“扦插的枝條”無性繁殖系 基因克隆（實為基因擴增） 細胞克隆（實為有絲分裂的細胞集落） 個體克隆（如植物快繁個體） 引伸為“克隆操作技術，即核移殖技術”,二、理論基礎： 體細胞具有細胞全能性,三、發展歷程：,622 細胞核移植（也是克隆技術關鍵）,一、定義 細胞核移植技術：是指利用顯微操作技術將 某種動物細胞核移入同種或異種動物的去核成熟 卵內的精細技術； 它可分為胚胎細胞核移植和體細胞核移植； 它可用于發育生物學、細胞生物學、分子生 物學等問題的研究，實現不同細胞核與細胞質的 組配，還能培育出新物種。,二、發展歷程,三、核移植技術,供體和受體的準備 魚類： 供體囊胚細胞或成體細胞， 受體成熟的卵細胞 發育 （人工催產、水中激活） 時間 兩棲類： 配合 供體囊胚細胞或成體細胞， 好 受體成熟卵細胞（人工針刺）,鳥類、爬行類：未知 哺乳類： 供體早期胚胎細胞、胚胎干細胞、體細 胞；后用體細胞，如乳腺細胞、粘 膜上皮細胞；合子核到64細胞期， 0.2%鏈霉蛋白酶預處理,溶去胚胎 膠膜及透明帶,分離單個卵裂球； 受體去核卵母細胞、受精卵、2細胞胚 胎（第一極體成熟時期去核）；,去卵膜和卵核用玻璃微針（尖為2-4um） 魚卵借助第二極體標志，去核； 兩棲卵紫外線去核； 哺乳卵借助第一極體； 供體細胞制備： 胚胎或組織機械切割 置細胞分離液 （含胰蛋白酶）處理幾分鐘 單細胞短期培養 移植 選擇合適微吸管（比細胞核大，比供體細胞小 ），不能多帶細胞質，須30-40min內完成操作過 程，溫度16-18C；,顯微操縱術：原子力顯微鏡、顯微操縱儀；,顯微操作儀,核移植操作過程,623 克隆動物一般制備技術,一、胚胎細胞核移植法 世界： 1984年，英，綿羊; 1995年，日本； 1997年，澳大利亞，孿生牛; 1998年，食用牛 目前，小鼠、兔、山羊、綿羊、豬、羊、猴 中國： 1990年，中國發育所，兔；西北農大，山羊; 1991年，臺灣，豬 ; 1992年，江蘇農科院，兔 ; 1995年，中國發育所與揚州大學，山羊; 1995年，華南師院與廣西師大，克隆雜色牛; 1995年，西北農大，豬 1996年，湖南醫科大，小鼠,二、胚胎干細胞核移植： 鼠，8細胞前胚胎， 細胞全能性明顯 三、胎兒成纖維細胞核移植： 1996年，3只山羊,624 體細胞克隆技術,一、體細胞克隆技術： 是指將動物體細胞經過抑制培養， 使其處于休眠狀態，利用細胞核移植技 術將其導入去核卵母細胞，發育成胚胎 后移植到受體，妊娠產仔，克隆出非成 體動物。,20世紀，50年代，體細胞克隆出成體 蛙，但哺乳類個體不成功 1997、2、23，英格蘭、愛丁堡羅斯林 研究所與PPL制藥公司，伊恩.維爾穆特博 士研究小組，用白綿羊細胞核+黑綿羊去 核卵母細胞，培育出克隆綿羊“多莉”，現 存活,1998、7，美國，夏威夷大學，用豚鼠細 胞核+黑鼠去核卵細胞，培育出50只克隆鼠 ，克隆豬 2002、1，中國，克隆牛（盧光銹，中南 大學，干細胞，克隆人胚胎）,2005、8，經過李寧教授領導的課題組 一年多的科技攻關，8月5日，我國第一頭 體細胞克隆豬終于在河北省三河成功誕生 。該項目得到了國家重點基礎研究發展規 劃“973”項目以及北京市自然科學基 金資助。,2005、12，中國農業大學，高產奶牛體細胞 克隆技術的研究獲得突破，利用成年母奶牛成 纖維細胞、顆粒細胞和胎兒成纖維細胞、胎兒輸 卵管上皮細胞作為供體核克隆時重構胚的囊胚發 育率，分別為41%、41%46%和39%。克隆胚胎 的移植后60天妊娠檢查時，妊娠率為35.2% （51/145），妊娠母牛早期流產率為15.2% （8/51，指妊娠159天前），早產率為4% （2/51，指妊娠7-8個月）。,體細胞克隆高產奶牛,2006、2，美國科學雜志日宣 布，韓國和美國科學家成功克隆出了人類早 期胚胎，并從中提取出胚胎干細胞。這是科 學家首次利用克隆技術獲得人類胚胎干細 胞。 漢城國立大學和美國密歇根州立大學等 機構的科學家參與了這項研究。名健康 婦女為這項研究志愿捐獻了個卵細胞 以及被稱為卵丘細胞的體細胞。,科學家們從卵丘細胞內提取出細胞核，然后將其 植入同一位婦女去除了細胞核的卵細胞內，并采用 化學手段刺激卵細胞分裂，共有個克隆細胞經 過約天的時間發育到至少幾十個細胞組成的、被 稱為胚囊的早期胚胎階段。科學家們從這些胚囊中 分離出個內層細胞團，并在此基礎上最終獲得 一個人類胚胎干細胞系。實驗顯示，利用這種辦法 獲得的胚胎干細胞具有多能性，可分化成骨骼細 胞、肌肉細胞和未成熟的腦細胞等多種細胞類型。,克隆人早期胚胎(1),克隆人早期胚胎(2),2006、3，中國首批轉基因體細胞克隆牛的再克隆體日前成功降生。,克隆羊借腹生子津城落地,克隆動物可以自然交配,中國轉基因克隆技術再破難關,熒光小豬,625 克隆技術的應用與意義,一、無性繁殖意義為：有利于保護柔弱的 胚胎期；有利于大量快速繁殖。 二、檢驗動物細胞全能性（理論上）； 三、加速動物繁殖，優良育種，保護珍稀 動物； 四、用于醫藥領域克隆動物（器官大 小與人相當），培育組織、器官，如 用豬肝、羊顱骨、雞肌腱、豬關節軟 骨作替代器官；,626 存在的問題,一、技術尚不成熟：克隆動物成功率低，死亡 率高； 二、克隆動物的體細胞突變、壽命和其他遺傳 問題，如無遺傳物質交換，適應力差，易 突變； 三、理論問題：克隆并非完全復制，體細胞也 有變異，理論問題值得深入； 四、社會倫理問題：從醫學上講，贊同者多； 從倫理上講，反對者多；難判斷；,627 克隆技術發展趨勢,克隆技術與轉基因技