1、.,細菌內毒素檢查結果準確性的 影響因素,.,一、試驗誤差分析及改進措施 鱟試劑質量及靈敏度標示值得的影響 細菌內毒素工作標準品效價及使用的影響 實驗器皿的的影響 樣品成份及理化性質的影響 實驗員的影響 環境的影響,.,1 鱟試劑質量及靈敏度標示值得的影響 鱟試劑的質量：抗干擾能力，穩定性； 鱟試劑靈敏度標示值的準確性 。 鱟試劑靈敏度的誤差 是否用細菌內毒素國家標準品標定？ 標示值是否準確？,.,2 細菌內毒素標準品引起的誤差 細菌內毒素標準品種類 細菌內毒素標準品效價誤差 細菌內毒素標準品操作誤差 細菌內毒素單位表示誤差 細菌內毒素標準品的錯誤使用,.,1） 細菌內毒素標準品種類 細菌內毒

2、素國際標準品 細菌內毒素國家標準品 細菌內毒素工作標準品,.,2） 細菌內毒素標準品效價誤差 細菌內毒素國家標準品與細菌內毒素工作標準品之間或細菌內毒素工作標準品與細菌內毒素工作標準品之間的生物效價存在一定的誤差，用不同細菌內毒素標準品復核同一批鱟試劑靈敏度時可能存在一定的誤差。中國藥典要求“當c在0.5-2(包括0.5和2)時，方可用于細菌內毒素檢查，并以標示靈敏度為該批鱟試劑的靈敏度。”試驗結果只要在這合格范圍內表示鱟試劑標示靈敏度準確。,.,3） 內毒素標準品操作誤差,取細菌內毒素工作標準一支，輕彈瓶壁，使粉末落入瓶底，再用砂輪在瓶頸上部輕輕劃痕，用75%酒精棉球擦拭后啟開，防止玻璃屑落

3、入瓶內。,正確,（易折點）錯誤,.,注意：只能在安瓿的易折點上部開啟內毒素，不能沿易折點開啟，防止振蕩過程中內毒素粘在封口膜上。 只能取1ml的細菌內毒素檢查用水復溶細菌內毒素工作標準品。 若使用的為細菌內毒素國家標準品，可按其使用說明書中的方法將其稀釋至規定濃度后分裝保存。若為細菌內毒素工作標準品，為一次性使用。,.,4） 錯誤使用 有部分客戶使用廠家生產的細菌內毒素來復核鱟試劑的靈敏度，這是一種錯誤行為，更有甚者使用廠家生產的細菌內毒素來交叉復核鱟試劑的靈敏度，這是一種嚴重錯誤行為。,.,3 實驗器皿的影響 器皿的計量管理（校正） 器皿的選擇標準 器皿的正確處理,.,1） 器皿的選擇標準

4、鱟試驗對器皿的要求：刻度準確；內表面光滑；易于清理。細菌內毒素檢查實驗不宜選用注射器，最好使用經過校正的刻度玻璃吸管或吸嘴。注射器刻度不精確，內壁磨沙面吸附內毒素，而且要特別注意注射器針頭引入的鐵離子對試驗結果的干擾，故不宜選用注射器。,.,如果用量不大，使用頻率不高，建議大家選用本公司提供的一次性耗材。無熱原耗材是一種在此行業中被鑒定為無內毒素和-葡聚糖污染的產品，其中包括, 無熱原試管、無熱原移液器吸頭。這些產品可以給您的工作帶來很大方便,另外，當實驗出現誤差時可首先排除器皿方面的因素,很快分析判斷出誤差原因。,.,2） 器皿的正確處理 2005年版中國藥品檢驗標準操作規范278頁細菌內毒

5、素檢查法“實驗準備”規定：“將被洗滌的玻璃器皿用洗滌劑和自來水洗凈并烘干水分后，置洗液中浸泡4小時，取出將洗液瀝干，用自來水將殘余的洗液洗凈，再用蒸,.,餾水沖洗干燥后置適宜的密閉金屬容器中，迅速置烤箱中，除去玻璃器皿表面可能存在的外源性內毒素。” 應該特別注意，該規程明確規定最后沖洗玻璃器皿必須“用蒸餾水沖洗，禁用純化水沖洗。”有的客戶使用反滲透制備的純化水沖洗試驗用玻璃器皿，結果試驗中所有的陽性對,.,照都為陰性，復核鱟試劑靈敏度時試驗結果誤差較大，這主要是由于純化水和蒸餾水的質量不同所造成的。因純化水中存在的陰陽離子經250高溫干烤不能完全被破壞，這時不同的離子就產生對鱟試劑酶反應抑制或

6、增強的反應，為了保證試驗結果的準確性和檢驗報告的權威性，我們應該嚴格遵守操作規程，用多效蒸餾水沖洗鱟試驗用玻璃器皿。,.,4 樣品成份及理化性質的影響 -葡聚糖樣物質的影響 PH值的影響 金屬離子和弱酸陰離子的影響 藥物濃度的影響,.,1） -葡聚糖樣物質的影響 常見現象：假陽性。 鱟試劑的特異性系指在藥品、生物制品和血液制品中鱟試劑能準確測出被測物質內毒素的能力，既不能造成樣品內毒素的漏檢，也不能將其它物質錯判為內毒素。,.,目前我公司研究證明，已知能與鱟試劑發生反應的物質有細菌內毒素和-葡聚糖，而內毒素反應曲線為S型特征曲線，-葡聚糖反應曲線為經過0點的斜線。鱟試劑的特異性差的另一種表現，

7、是將其它物質（如-葡聚糖）判定為內毒素，錯誤將合格藥品判為不合格，造成制藥廠直接經濟損失。,.,鱟試劑反應機理圖,.,判斷假陽性的方法： 1、特異性鱟試劑法； 2、定量反應曲線分析法； 3、家兔模擬試驗法。,.,2） PH值對反應速度的影響 常見現象：樣品陽性不成立。 鱟試劑與內毒素反應的最適宜pH在6.5-8.0；pH 3 或10時，酶活性受到抑制。,相對活力,PH,7.0,.,PH對反應速度的影響: 影響酶原的激活； 影響酶分子的構象，過高過低的PH會改變酶的活性中心的構象，或甚至改變整個酶分子的機構使其變性失活。,.,故鱟試驗時，供試品 pH 最好應預調和6.5-8.0 為好，必要時可用

8、無內毒素的 HCl 或NaOH 稀溶液調節 pH 值。美國、日本藥局方以及中國藥典故2005版規定檢品必須調節PH值6.0-8.0。,.,3） 金屬離子和弱酸陰離子 離子對細菌內毒素測定結果影響較大，一方面陽離子如Fe3+、Al3+強度較大會引起內毒素的聚集造成內毒素局部濃度過高，同時還必須注意高價陽離子（如Fe3+）的氧化性對鱟試劑酶反應具有強抑制作用；重金屬離子如Ag+、Cu2+、Pb2+可以使蛋白質變性而使酶失活；另一方面鱟試劑必須在二價陽離子Ca2+、Mg2+的參與下才能被激活形成凝膠反應。許多藥物因PH值10時，其中的陰離子會吸收鱟試劑中的Ca2+、Mg2+離子，使實驗呈假陰性。,.

9、,4） 藥物濃度 1、10%葡萄糖注射液 2、白蛋白、小牛血清 3、醫用透明質酸鈉 4、中藥類注射液,.,5 實驗員的影響 操作時嚴格按操作規程進行，安瓿開啟前應先用酒精棉球擦拭曲頸部，用將頸部折斷，防止碎玻屑掉入安瓿內。在鱟試劑的溶解、樣品的稀釋及加樣時，取樣均應準確。如果一人獨立完成試驗，可先稀釋配制好內毒素標準溶液和樣品溶液，然后開啟復溶鱟試劑，最后加樣，盡可能縮短鱟試劑溶液暴露在空氣中的時間（最好控制在15分鐘內）。,.,6、環境的影響 保溫時間 保溫溫度 1）保溫溫度 將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，然后分別放置于25、28、31、34、37、41、43、46、49水浴保溫。實驗中觀察到凝膠形成的速度隨著溫度的升高而加快，但到達49保溫90min也未出現凝膠。,.,從實驗可以看出，溫度對鱟試劑的靈敏度影響很大，保溫溫度在2541之間，隨著溫度的升高，反應速度也升高，41尚未達到反應速度峰值，25 時反應速度已相當快；在4146之間，溫度對鱟試劑的靈敏度無明顯影響；達到49或更高溫度時，隨溫度升高而使酶蛋白逐漸變性，則鱟試劑被破壞，反應速度反而降低。,.,2）保溫時間 將細菌內毒素工作標準品用細菌內毒素檢查用水稀釋成2，進行鱟試驗，37保溫，分別在10、20、30、40、50、70min時觀察，發現