ICS65.020.20CCSB3112天津市地方標(biāo)準(zhǔn)DB12/T1292—2023花椰菜主要流行病害抗性鑒定技術(shù)規(guī)程Technicalstandardsforidentificationofresistancetoimportantepidemicdiseasesincauliflower天津市市場監(jiān)督管理委員會(huì)發(fā)布DB12/T1292—2023前言本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》的規(guī)定起草。本文件由天津市農(nóng)業(yè)農(nóng)村委員會(huì)提出并歸口。本文件起草單位：天津科潤農(nóng)業(yè)科技股份有限公司、天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院。本文件主要起草人：孫德嶺、姚星偉、張小麗、牛國保、單曉政、文正華、劉莉莉、江漢民。IDB12/T1292—2023花椰菜主要流行病害抗性鑒定技術(shù)規(guī)程1范圍本文件規(guī)定了花椰菜主要流行病害抗性鑒定的試劑、儀器設(shè)備、病原菌接種體制備、病原菌接種方法、病情調(diào)查、群體抗病性評價(jià)、鑒定記載等的要求。本文件適用于花椰菜主要流行病害抗性鑒定。2規(guī)范性引用文件下列文件中的內(nèi)容通過文中的規(guī)范性引用而構(gòu)成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，僅該日期對應(yīng)的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T6682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法3術(shù)語和定義本文件沒有需要界定的術(shù)語和定義。44.1BL培養(yǎng)基葡萄糖10.0g，肉膏3.0g，肝浸出液150.0ml，植胨3.0g，L-半胱氨酸·HCL0.5g，朊蛋白胨10.0g，可溶性淀粉0.5g，吐溫801.0g，胰酪胨5.0g，酵母膏5.0g，溶液A（25gKH2PO4、35gK2HPO4溶于蒸餾水并定溶至250ml）10.0ml，溶液B（0.5gFeSO4·7H2O、10.0gMgSO4·7H20、0.337gMnSO4·2H2O和0.5gNaCl溶于蒸餾水并定容至250ml）5.0ml，瓊脂15.08g，加蒸餾水至1000ml。pH值調(diào)至7.2，高溫滅菌后備用。4.2量取500ml水，加入玉米粉30g，保持溫度在60℃左右約1h，用紗布過濾后，加入適量的水補(bǔ)足500ml。另取500ml水，加入瓊脂17g，加熱使之慢慢融化，過濾后補(bǔ)足水至500ml。兩液混合后分裝，高溫滅菌后備用。玉米粒煮熟煮熟，高溫滅菌4.370%乙醇溶液51DB12/T1292—20235.15.25.35.45.55.65.75.85.9恒溫?fù)u床回旋頻率范圍：40r/min～300r/min；溫度控制范圍：5℃～60℃。恒溫培養(yǎng)箱溫度范圍：0℃～℃0℃；溫度波動(dòng)范圍：±0.5℃。低溫冰柜箱內(nèi)溫度：-15℃～-25℃。滅菌鍋溫度范圍：0℃～135℃；滅菌時(shí)間：4min～120min；最高工作壓力：0.22MPa。超凈工作臺(tái)潔凈等級：100級@≥0.5μ；平均風(fēng)速：0.25m/s～0.6m/s。電子天平感量0.01g。血球計(jì)數(shù)板規(guī)格16×25或者25×16。離心機(jī)物鏡倍數(shù)：10×、20×、50×、100×；目鏡倍數(shù)10×。66.1從花椰菜黑腐病樣采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，并對分離物進(jìn)行鑒定，采用單孢分離法進(jìn)行分離純化，經(jīng)柯赫（Koch）法則回接驗(yàn)證后，保存?zhèn)溆谩＝臃N前將供試菌株轉(zhuǎn)接于BL液體培養(yǎng)基上，置于28℃搖床恒溫培養(yǎng)1天后取出，加入適量無菌水稀釋，用血球計(jì)數(shù)板調(diào)整菌液濃度至1×10CFU/ml，置8于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.2采集花椰菜霜霉病病葉表面著生的霉層及其附著物用無菌水沖凈，再用無菌水沖洗3遍，將洗凈的病葉放入無菌培養(yǎng)皿中置于溫度20℃、相對濕度95%的培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)1d。之后用濕棉球?qū)⑿庐a(chǎn)生的孢子囊輕輕剝落于無菌水中制成懸浮液，通過顯微鏡觀察其孢子形態(tài)進(jìn)行病原菌鑒定，利用血球計(jì)數(shù)板6.32DB12/T1292—2023從花椰菜菌核病樣采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，采用單孢分離法進(jìn)行分離純化，經(jīng)柯赫（Koch）法則回接驗(yàn)證后，保存?zhèn)溆谩＝臃N前將菌株置于22℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天～4天至長出白色菌絲進(jìn)行活化，用滅菌的5mm打孔器制備接種用菌餅備用。6.4黑斑病菌接種體制備從花椰菜黑斑病樣采用常規(guī)組織分離法分離病原菌，采用單孢分離法進(jìn)行分離純化，經(jīng)柯赫（Koch）法則回接驗(yàn)證后，保存?zhèn)溆谩＝臃N前將菌株轉(zhuǎn)接到玉米粒培養(yǎng)基，置于25℃，培養(yǎng)15天，取出光照4h，用雙層無菌紗布保濕48h，用無菌水洗刷孢子濃度至1×10CFU/ml，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?6.5根腫病病菌接種體制備將新鮮的花椰菜腫根取500g攪碎，4層紗布過濾，2500r/min離心5min，棄上清液；用無菌水懸浮沉淀，重復(fù)3次，用血球計(jì)數(shù)板統(tǒng)計(jì)接種液濃度至1×10CFU/ml，置于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?7室內(nèi)接種鑒定7.1鑒定室人工接種鑒定室可以選擇能進(jìn)行溫濕度及光照調(diào)控的人工氣候室或氣候箱。7.27.3鑒定設(shè)計(jì)鑒定材料隨機(jī)排列，每份材料重復(fù)3次，每個(gè)重復(fù)10株苗。鑒定材料育苗鑒定種子在1%次氯酸鈉溶液中浸泡10min，清水沖洗后置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽或直接播種于育苗盤內(nèi)。裝入準(zhǔn)備好的育苗基質(zhì)土，防蟲網(wǎng)內(nèi)或日光溫室內(nèi)育苗，室內(nèi)溫度白天控制在22℃～25℃，夜晚控制在17℃～20℃，待幼苗長至4片～5片真葉時(shí)進(jìn)行抗病性鑒定。88.1采用噴霧方法接種。待花椰菜幼苗長至4片～5片真葉時(shí)，移到人工氣候室內(nèi)保濕一夜，使其葉緣出現(xiàn)露珠，第二天制備接種菌液并用小型噴霧器進(jìn)行噴霧接種，均勻噴施至葉片上，在人工氣候室內(nèi)24h相對濕度95%～100%，24h后降低相對濕度至80%～85%，28℃，14h光照，7天后調(diào)查記載發(fā)病情況。8.2采用噴霧法接種。將菌液倒入小型噴霧器中，在接種材料的葉片背面噴灑，每株100μL。接種后將溫度控制在18℃～25℃，黑暗條件下相對濕度95%～100%保濕24h，24h后降低相對濕度至80%～85%，25℃，14h光照，7天后進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。8.3采用貼菌片接種。當(dāng)花椰菜幼苗4片～5片真葉時(shí)移到人工氣候箱內(nèi)保濕過夜，使其葉面濕潤，將直徑5mm菌片帶菌絲面貼于幼苗的第3片真葉，用保鮮膜保濕，接種后24h保持在20℃～23℃，相對濕度95%～100%，24h后降低相對濕度至80%～85%，7天后進(jìn)行病害調(diào)查。3DB12/T1292—20238.4黑斑病接種采用噴霧法接種，將制備好的孢子懸液均勻噴灑于幼苗葉片表面，每株100μL。接種后將溫度控制在20℃左右，黑暗條件下相對濕度95%～100%，24h后降低相對濕度至80%～85%，25℃，14h光照，7天后進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。8.5根腫病接種采用傷根灌菌法。取4片～5片真葉的花椰菜幼苗，在幼苗根部一側(cè)用滅菌刀片將部分根輕輕劃傷，給根系造成機(jī)械傷害，將1×10CFU/ml接種菌液5ml灌入傷根部位。接種6周后進(jìn)行發(fā)病情況調(diào)查。89病情調(diào)查9.1病情級別花椰菜主要流行病害病情級別劃分見表1。表1花椰菜主要流行病害病情級別劃分病情級別黑腐病無病癥霜霉病無病癥菌核病無病癥黑斑病無病癥根腫病無病癥01級水孔處有黑色枯死點(diǎn)，無擴(kuò)展接種點(diǎn)上有稀疏病斑，不擴(kuò)散病斑僅出現(xiàn)在接病斑面積占整個(gè)種點(diǎn)處，無擴(kuò)展葉面積5%以下根腫只附著在側(cè)根，數(shù)量占根系全部的1%～10%3級5級7級9級病斑從水孔向外擴(kuò)展，占葉面積5%以下葉片有較多病斑，所屬凹陷，葉片背面無霉層發(fā)病葉片病斑面病斑面積占整個(gè)積占葉片面積的葉面積5%～10%10%以下主根有根腫附著，側(cè)根上根腫數(shù)量占10%～25%以上發(fā)病葉片病斑面病斑面積占整個(gè)根腫數(shù)量占25%～50%，主根有附著積占葉片面積的葉面積11%～20%10%～30%病斑從水孔向外病斑面積達(dá)50%～發(fā)病葉片病斑面病斑面積占整個(gè)根腫數(shù)量占51%～75%，主根有附著積占葉片面積的葉面積21%～50%31%～50%病斑從水孔向外病斑面積70%以上，發(fā)病葉片病斑面病斑面積占整個(gè)根腫數(shù)量占75%以上，擴(kuò)展，占葉面積積占葉片面積的葉面積50%以上50%以上50%以上9.2調(diào)查每份鑒定材料接種葉片或根系發(fā)病情況，根據(jù)病害癥狀描述，逐份材料進(jìn)行調(diào)查，記載接種病······································································(1)×4DB12/T1292—202310群體抗病性評價(jià)10.1抗病性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)花椰菜主要流行病害抗性鑒定評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見表2。表2花椰菜主要流行病害抗性評價(jià)標(biāo)準(zhǔn)病情級別黑腐病霜霉病菌核病黑斑病根腫病免疫（I）DI=0.00DI=0.00DI=0.00DI=0.00DI=0.00高抗（HR）0＜DI≤11.11抗病（R）11.11＜DI≤33.33中抗（MR）33.33＜DI≤55.55感病（S）55.55＜DI≤67.77高感（HS）DI＞67.770＜DI≤11.1111.11＜DI≤33.3333.33＜DI≤55.5555.55＜DI≤77.77ID＞77.770＜DI≤55＜DI≤2020＜DI≤4040＜DI≤70ID＞700＜DI≤1515＜DI≤3030＜DI≤4545＜DI≤70DI＞700＜DI≤12.512.5＜DI≤2525＜DI≤4545＜DI≤65DI＞6510.2有效性判別感病對照材料達(dá)到其感病程度，抗病對照材料與實(shí)際抗性程度相符，該批次抗病鑒定結(jié)果視為有效。鑒定材