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團體標準

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高通量測序法篩選疫苗候選株質量控制評

價技術規范

QualityControlofEvaluationandTechnicalspecificationforvaccinecandidates

strainscreeningbyhigh-throughputsequencing

（本草案完成時間：2024-4）

XXXX-XX-XX發布XXXX-XX-XX實施

發布

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高通量測序法篩選疫苗候選株質量控制評價技術規范

1范圍

本文件規定了高通量測序法篩選滅活疫苗候選株的質量控制評價技術規范。

本文件適用于規范應用高通量測序法篩選滅活疫苗候選株，指導疫苗候選株的篩選。

本文件適用于疫苗行業中涉及利用高通量測序法篩選滅活疫苗候選株的研發機構和企業等。

2規范性引用文件

下列文件中的內容通過文中的規范性引用而構成本文件必不可少的條款。其中，注日期的引用文件，

僅該日期對應的版本適用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本

文件。

中國藥典2020年版

GB/T29859-2013生物信息學術語

GB/T30989-2014高通量基因測序技術規程

GB/T34798-2017核酸數據庫序列格式規范

GB/T35890-2018高通量測序數據序列格式規范

T/GDPMAA0012-2023高通量基因測序項目分類

WS/T812-2022病原微生物菌（毒）種國家標準株評價技術標準

宏基因組高通量測序技術應用于感染性疾病原檢測中國專家共識

宏基因組測序病原微生物檢測生物信息學分析規范化管理專家共識

3術語和定義

下列術語和定義適用于本文件。

3.1

測序覆蓋度Sequencingcoverage

指達到給定深度的測序堿基占整個基因組或目標區域的百分比。

3.2

測序深度Sequencingdepth

在一次測序實驗中對特定基因組區域或整個基因組的測序覆蓋度。通常以X倍為單位來表示，如

1000X表示該基因組區域或整個基因組的堿基被測序1000次。

3.3

SAM/BAM格式SAM/BAMformat

SAM是基于文本的、存儲核酸序列和其測序質量信息的、以每一行表示一條序列、每行以制表符分

割成11列的標準格式，測序質量信息使用ASCII字符表示，BAM是SAM格式的二進制格式。

注：SAM和BAM也可作為序列比對格式。

3.4

參考基因組Referencegenome

測序片段對應的物種基因組序列。

3.8

疫苗候選株Vaccinecandidatestrain

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通過微生物學減毒操作或基因工程改造、毒株載體細胞的適應性培養及穩定傳代等技術篩選，獲得

的活性穩定，符合安全性和有效性評估要求，通過動物實驗和臨床試驗驗證能誘導宿主產生免疫應答反

應的菌（毒）株。

4縮略詞

下列縮略詞適用于本文件。

PCRPolymerasechainreaction

ASCIIAmericanStandardCodeforInformationInterchange

5疫苗候選株篩選的質量控制

5.1原始種子批候選樣本的質量控制

5.1.1原始種子批候選樣本的選擇

原始種子批候選樣本選擇足夠量的具有代表性的候選樣本進行生物學等研究和比較，選擇遺傳背

景清晰，外源因子檢測符合現行中國藥典及國家相關要求的候選樣本進行疫苗臨床前研發。

5.1.2原始種子批候選樣本的全基因組測序結果質量控制

5.1.2.1堿基質量值

Q30值大于85%。

5.1.2.2序列有效長度

序列有效長度需不小于100bp。

5.1.2.3覆蓋度

種子批候選樣本病原體測序覆蓋度達到98%以上。

5.1.2.4測序深度

病毒性疫苗種子批候選樣本測序深度不少于1000X，細菌性疫苗種子批候選樣本測序深度不少于

100X。

5.1.2.5分子遺傳特征

篩選所選樣本中病原微生物的分子遺傳特征，需符合目標病原微生物標準參考基因組序列的分子

遺傳特征。

5.1.2.6其他

其他涉及原始種子批候選樣本鑒定與檢測項目，如病毒性疫苗細胞基質等，均根據現行中國藥典要

求開展。

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5.1.3原始種子批候選樣本的宏基因組測序結果質量控制

5.1.3.1數據庫

宏基因組測序數據應與宿主基因組數據庫和微生物數據庫進行比對。用于比對的微生物數據庫庫

容應大于6萬，且比對的數據庫應包含細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體、立克次體等。

5.1.3.2接頭污染比例

不超過1%。

5.1.3.3序列有效長度

序列有效長度需不少于50bp。

5.1.3.4數據的有效比對率

數據的有效比對率大于70%。

5.1.3.5豐度值

除目標病原外，其他微生物豐度與陰性對照相應的微生物進行豐度值比對，差異在同一個數量級，

則可考慮保留該候選株。

5.1.3.6陰性對照

陰性對照應是以采樣基質液為陰性對照品。

5.1.3.7其他

其他涉及種子批候選樣本鑒定與檢測項目，均根據現行中國藥典要求開展。

5.2三級種子批系統的質量控制

5.2.1三級種子批系統的主要免疫原性基因組區域或全基因組測序結果基本質量控制

5.2.1.1堿基質量值

堿基質量值Q30大于90%。

5.2.1.2測序覆蓋度

測序覆蓋度達到99%以上。

5.2.1.3測序深度

病毒性疫苗三級種子批系統涉及到的各代次樣本測序深度達到6000X以上；細菌性疫苗三級種子批

系統涉及到的各代次樣本測序深度達到500X以上。

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5.2.2三級種子批系統的主要免疫原性基因組區域或全基因組測序結果遺傳穩定性的質量控制

5.2.2.1傳代

在同一實驗條件下，從種子批候選樣本的主要免疫原性基因組區域或全基因組序列穩定后應連續

傳代，通常應自主種子批代次起至少超過疫苗中病毒代次5代以上。

5.2.2.2全基因組序列一致

三級種子批所測得的主要免疫原性基因組區域或全基因組序列一致性大于99%。

5.2.2.3變異頻率

穩定后的各代次病原微生物基因層面與生物學功能相關的變異頻率應保持一致（p值大于0.05）。

5.2.3三級種子批系統的宏基因組測序結果基本質量控制

5.2.3.1數據庫

宏基因組測序數據應與宿主基因組數據庫和微生物數據庫進行比對。用于比對的微生物數據庫庫

容應大于6萬種微生物，且比對的數據庫應包含細菌、真菌、病毒、寄生蟲、支原體、衣原體、立克

次體等。

5.2.3.2接頭污染比例

不超過1%。

5.2.3.3序列有效長度

序列有效長度需不少于50bp。

5.2.3.4數據的有效比對率

數據的有效比對率大于70%。

5.2.3.5陰性對照

陰性對照應是以培養該候選株的培養基為陰性對照品

5.2.3.6其他

其他涉及三級種子批系統質量控制檢測，如菌（毒）種形態特性、培養特性、增殖能力、免疫學特

征、毒力、毒性、毒性逆轉、免疫原性、免疫力等試驗，以及其他外源因子檢測和無菌檢測等項目，均

根據現行中國藥典的要求開展。

4

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附錄A（資料性附錄）高通量宏基因組測序篩選疫苗候選株的流程示例

A.1病原體核酸提取

按照相應試劑盒說明書提取待測樣本總核酸（DNA和RNA）。

A.2文庫構建

按照相應試劑盒說明書，對提取的核酸進行反轉錄和擴增，構建適用于高通量宏基因組測序平臺的

文庫。

A.3高通量宏基因組測序

將構建好的文庫置于高通量測序平臺進行測序。

A.4數據分析

對測序數據進行質控和預處理，去除低質量的序列。利用生物信息學工具將測序數據與宏基因組數

據庫進行比對和注釋，以識別樣本中微生物的群體構成。

A.5豐度和純度分析

通過宏基因組數據庫的比對和注釋，得到樣本中非目標病原物外源微生物因子的豐度信息。通過評

估外源微生物因子（如支原體）的豐度，可以確定該樣本是否符合要求。其他外源微生物因子應符合現

行中國藥典的要求。

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附錄B（資料性附錄）高通量全基因組測序篩選疫苗候選株的流程示例

B.1病原物全基因組靶向捕獲

根據目標病原體的全基因組序列特性，若該目標病原體可以進行靶向捕獲，則設計全基因組靶向引

物或者使用成熟的商用試劑盒進行靶向捕獲；若目標病原體不適合靶向捕獲，則可以選擇不進行靶向捕

獲。

B.2核酸提取和質控

從待測樣本中提取核酸，并進行熒光定量PCR檢測，確認目標病原物。

B.3靶向擴增和文庫構建

若目標病原物可以進行靶向捕獲，則使用設計好的引物對目標病原物全基因組擴增。對擴增得到的

核酸片段進行文庫構建；若目標病原物不適合靶向捕獲，則根據相應試劑盒說明書進行文庫構建。通常

采用特定的文庫構建方法，以獲得適用于高通量測序的文庫。

B.4高通量測序

將構建好的文庫置于高通量測序平臺中進行測序。

B.5數據分析

對下機的原始測序數據進行質控和預處理，去除低質量的序列。利用序列比對軟件將過濾后的序列

比對到目標病原物參考基因組上，得到BAM格式的比對文件，經過序列去重與排序后，獲取目標病原物

的全基因組變異圖譜。

B.6遺傳穩定性評估

根據目標病原物全基因組的序列特征和變異圖譜，評估待測樣本的遺傳穩定性。