知識(shí)點(diǎn)1：限制酶切割一次的含義是指該酶在特定的DNA序列（識(shí)別序列）上進(jìn)行一次雙鏈切割，將DNA分子切斷。①斷裂的磷酸二酯鍵數(shù)目：2個(gè)②新增的游離磷酸基團(tuán)、游離羥基，各2個(gè)③形成的粘性末端數(shù)目：2個(gè)或0個(gè)知識(shí)點(diǎn)2：限制酶的專一性表現(xiàn)在：①常規(guī)情況：一種限制酶只能識(shí)別一種特定的脫氧核苷酸序列。②極少數(shù)酶可識(shí)別簡(jiǎn)并序列（含可變堿基）。

【變式】已知限制酶Ⅰ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—GGATCC—，限制酶Ⅱ的識(shí)別序列和切點(diǎn)是—↓GATC—。

（1）則能被限制酶I切割的DNA，______（能/不能）被限制酶II切割；

（2）能被限制酶II切割的DNA，____________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割。

（3）DNA1被限制酶I切割，DNA2被限制酶II切割，加入DNA連接酶可得到DNA1和DNA2的重組DNA片段，該重組DNA片段__________（能/不能/不一定能）被限制酶I切割，_______（能/不能/不一定能）被限制酶II切割。能不一定能能不一定例1.引物的結(jié)合方向如圖為X蛋白的部分基因序列，所示序列為引物結(jié)合的部分，據(jù)圖分析：擴(kuò)增X蛋白基因所需的引物序列是_________________________________；______________________________。5′-ATGCCGTAAGTCCTAC-3′5′-TGATCTACGGCTTACA-3′書(shū)寫(xiě)引物序列，一般從引物的5′端向3′端書(shū)寫(xiě)，避免誤判。圖中位于上方的模板鏈5′端磷酸基團(tuán)在左側(cè)，3′端羥基在右側(cè)，可知與上方模板鏈配對(duì)的引物5′端在右側(cè)，3′端在左側(cè)，引物序列為5′-TGATCTACGGCTTACA-3′。同理推測(cè)另外一條引物的序列。PCR的細(xì)節(jié)【回顧】PCR的過(guò)程步驟1、變性步驟2：復(fù)性步驟3：延伸循環(huán)①實(shí)質(zhì)：②條件：①實(shí)質(zhì)：②條件：兩種引物通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈DNA結(jié)合的過(guò)程。溫度下降到50℃①實(shí)質(zhì)：②條件：溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。溫度上升到72℃左右雙鏈DNA氫鍵斷裂解聚為單鏈的過(guò)程。溫度超過(guò)90℃步驟1、變性①實(shí)質(zhì)：②條件：雙鏈DNA氫鍵斷裂解聚為單鏈的過(guò)程。溫度超過(guò)90℃【分析1】若DNA分子長(zhǎng)度、CG含量、甲基化修飾存在差異時(shí)，其復(fù)性溫度是否相同？變性溫度的一般規(guī)律：DNA長(zhǎng)度偏長(zhǎng)、GC含量偏高、甲基化修飾程度偏高，變性時(shí)均需消耗更多能量，則變性溫度上升，但高溫長(zhǎng)時(shí)間變性可能導(dǎo)致DNA斷裂或酶失活。說(shuō)明：溫度對(duì)酶的傷害會(huì)隨時(shí)間和溫度積累，為了保持PCR的擴(kuò)增效率，在不影響結(jié)果的情況下，盡可能使PCR的時(shí)長(zhǎng)縮短步驟2：復(fù)性①實(shí)質(zhì)：②條件：兩種引物分別通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)與兩條單鏈模板DNA結(jié)合的過(guò)程。溫度下降到50℃【思考】怎樣確保在復(fù)性時(shí)是引物與模板配對(duì)結(jié)合，而不是模板鏈之間配對(duì)結(jié)合呢？

只要引物是過(guò)量的，模板與引物配對(duì)結(jié)合的概率就特別高，就能保證復(fù)性時(shí)是引物和模板鏈配對(duì)結(jié)合。復(fù)性溫度與哪些因素有關(guān)呢？拓展1：Tm值1、Tm值=4(G+C)+2(A+T)2、大量研究證實(shí)，在PCR的復(fù)性過(guò)程中，當(dāng)復(fù)性溫度接近Tm值時(shí)，引物與模板鏈之間形成的氫鍵穩(wěn)定，形成的非特異性結(jié)合相對(duì)較少。3、一般來(lái)說(shuō)，復(fù)性溫度會(huì)比Tm值低幾度（如3-5℃），以確保引物能夠在復(fù)性階段充分結(jié)合到目標(biāo)DNA上，同時(shí)避免過(guò)高的溫度導(dǎo)致引物與模板DNA的解離。拓展：非特異性結(jié)合是指引物部分匹配非目的基因的DNA序列，結(jié)合到錯(cuò)誤位置。將產(chǎn)生雜帶或不能得到目的基因。拓展2：復(fù)性溫度與特異性結(jié)合之間的關(guān)系拓展：復(fù)性溫度取決于引物的Tm值，一般比兩條引物的平均Tm值低3°C為宜【小結(jié)】步驟2：復(fù)性1、引物的量：保證引物是過(guò)量的，使模板與引物配對(duì)結(jié)合的概率提高。2、復(fù)性溫度與擴(kuò)增特異性的關(guān)系引物中GC含量是影響復(fù)性溫度的核心因素，通常：高GC需提復(fù)性高溫度（降低taq酶活性），低GC需降低溫度（導(dǎo)致非特異性結(jié)合或無(wú)法穩(wěn)定結(jié)合）。引物長(zhǎng)度越長(zhǎng)，越容易形成氫鍵，出現(xiàn)非特異性結(jié)合。通常：為避免出現(xiàn)錯(cuò)配，引物偏長(zhǎng)時(shí)需要適當(dāng)提高復(fù)性溫度（降低taq酶活性），引物偏短時(shí)需降低溫度（導(dǎo)致非特異性結(jié)合或無(wú)法穩(wěn)定結(jié)合）；復(fù)性溫度：復(fù)性溫度高，擴(kuò)增特異性強(qiáng)；復(fù)性溫度低，擴(kuò)增非特異性強(qiáng)。3、引物對(duì)復(fù)性溫度的影響步驟3：延伸①實(shí)質(zhì)：②條件：溶液中的4種脫氧核苷酸在耐高溫的DNA聚合酶（Taq酶）的作用下，根據(jù)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則合成新的DNA鏈。溫度上升到72℃左右【分析2】若DNA分子長(zhǎng)度、CG含量、甲基化修飾存在差異時(shí)，其延伸溫度是否有差異？一般規(guī)律：延伸溫度通常固定為72℃長(zhǎng)片段需延長(zhǎng)延伸時(shí)間，高GC需添加劑輔助，甲基化影響較小。原因1：保證Taq酶活性（72℃是Taq酶最適溫度）原因2：防止DNA變性（溫度過(guò)高DNA易變性）【小結(jié)】PCR三個(gè)步驟的溫度要求1、一般遵循教材的溫度設(shè)定2、當(dāng)DNA分子在長(zhǎng)度、CG含量、甲基化修飾等特點(diǎn)時(shí)需做調(diào)整。（1）變性溫度：通常：DNA長(zhǎng)度偏長(zhǎng)、GC含量偏高、甲基化修飾程度偏高，變性時(shí)均需消耗更多能量，則變性溫度上升，但高溫長(zhǎng)時(shí)間變性可能導(dǎo)致DNA斷裂或酶失活。（2）復(fù)性溫度：GC含量是影響復(fù)性溫度的核心因素，通常：高GC需提復(fù)性高溫度，低GC需降低溫度。②DNA長(zhǎng)度、甲基化DNA對(duì)退火溫度影響較小。（3）延伸溫度：延伸溫度通常固定為72℃（Taq酶最適溫度）。長(zhǎng)片段需延長(zhǎng)延伸時(shí)間，高GC需添加劑輔助，甲基化影響較小。學(xué)情檢測(cè)（2017年江蘇卷）如果PCR反應(yīng)得不到任何擴(kuò)增產(chǎn)物，可采取的改進(jìn)措施有______（填序號(hào)）。①升高退火溫度;②降低退火溫度;③重新設(shè)計(jì)引物。PCR擴(kuò)增時(shí)，退火溫度的設(shè)定是成敗的關(guān)鍵。退火溫度過(guò)高會(huì)破壞____________的堿基配對(duì)。退火溫度的設(shè)定與引物長(zhǎng)度、堿基組成有關(guān)，長(zhǎng)度相同但____________的引物需要設(shè)定更高的退火溫度。②③引物與模板GC含量高【分析】當(dāng)溫度已經(jīng)設(shè)定準(zhǔn)確后，擴(kuò)增出的產(chǎn)物中仍有有一些錯(cuò)誤的片段，

可能是什么原因?qū)е碌模俊痉治觥慨?dāng)溫度已經(jīng)設(shè)定準(zhǔn)確后，擴(kuò)增出的產(chǎn)物中仍有有一些錯(cuò)誤的片段，

可能是什么原因?qū)е碌模靠赡茉颍?、引物失效2、引物特異性不高3、模板數(shù)量太多4、Mg2?缺失（或濃度不合適）5、產(chǎn)物被污染6、模板不純等引物為什么會(huì)失效？例：分析下列兩組引物可能出現(xiàn)的問(wèn)題第1組：

；第2組：

。引物Ⅰ和引物Ⅱ之間會(huì)因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效引物Ⅰ′自身折疊后會(huì)因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效【重難點(diǎn)】引物設(shè)計(jì)的要求:1、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，沒(méi)有連續(xù)的GC分布,避免引物自身因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)（形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)）而失效.2、引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，避免引物之間因出現(xiàn)局部堿基互補(bǔ)配對(duì)（形成引物二聚體）而失效.【重難點(diǎn)】引物設(shè)計(jì)的要求:為何有的引物與模板結(jié)合的特異性不高？出現(xiàn)非特異性結(jié)合？原因：①引物與非目的擴(kuò)增區(qū)域相似度高；②引物自身的長(zhǎng)度偏長(zhǎng)或偏短、GC含量偏高；③復(fù)性溫度偏低【重難點(diǎn)】引物設(shè)計(jì)的要求:3、確保引物特異性：與非目的基因擴(kuò)增區(qū)域要有明顯差異4、引物長(zhǎng)度適中：通常為20-30個(gè)核苷酸，以保證引物與模板的特異性結(jié)合。（1）引物過(guò)短、過(guò)長(zhǎng)均易發(fā)生非特異性結(jié)合（2）引物過(guò)長(zhǎng)：①自身因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效②導(dǎo)致復(fù)性困難（復(fù)性溫度升高）使：PCR擴(kuò)增特異性、擴(kuò)增效率下降（目標(biāo)產(chǎn)物少）有可能降低Taq酶的活性（或短暫失活）真題鏈接（2021年全國(guó)卷）：

“設(shè)計(jì)引物時(shí)通常選擇20-24個(gè)堿基，主要目的是_______________。保證特異性結(jié)合【重難點(diǎn)】引物設(shè)計(jì)的要求:5、引物的CG含量適中，（1）含量太高、太低均易發(fā)生非特異性結(jié)合（2）含量太多一般在40%~60%之間自身因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效②導(dǎo)致復(fù)性困難（復(fù)性溫度升高）有可能降低Taq酶的活性（或短暫失活）使：PCR擴(kuò)增特異性、擴(kuò)增效率下降（目標(biāo)產(chǎn)物少）（3）上下游引物GC含量相差不能太大,保一對(duì)引物證退火溫度差異不大。【重難點(diǎn)】引物設(shè)計(jì)的要求:5、引物的CG含量適中，（1）含量太高、太低均易發(fā)生非特異性結(jié)合（2）含量太多一般在40%~60%之間自身因局部發(fā)生堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效②導(dǎo)致復(fù)性困難（復(fù)性溫度升高）有可能降低Taq酶的活性（或短暫失活）使：PCR擴(kuò)增特異性、擴(kuò)增效率下降（目標(biāo)產(chǎn)物少）（3）上下游引物GC含量相差不能太大,保一對(duì)引物證退火溫度差異不大。【思考1】要保證目的基因能與載體相連接，還要對(duì)引物進(jìn)行什么操作？要在兩種引物的5′端分別添加上限制酶的識(shí)別序列。6、引物5'端可以修飾，3'端不可修飾引物5’端修飾包括：加酶切位點(diǎn)、加標(biāo)記熒光、引入突變序列、引入啟動(dòng)子序列等。【重難點(diǎn)】引物設(shè)計(jì)的要求:擴(kuò)增特異性擴(kuò)增高效性引物一般規(guī)律：特異性太強(qiáng)，擴(kuò)增效率就會(huì)下降提高擴(kuò)增效率，擴(kuò)增特異性就會(huì)下降【思考2】設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)重點(diǎn)考慮特異性還是效率呢？特異性【小結(jié)】引物設(shè)計(jì)的要求:3、確保引物特異性：與非目的基因擴(kuò)增區(qū)域要有明顯差異

（不能有連續(xù)8個(gè)互補(bǔ)堿基同源）4、引物長(zhǎng)度適中：通常為20-30個(gè)核苷酸，以保證引物與模板的特異性結(jié)合。5、引物的CG含量適中，兩種引物的CG含量不能有太大差異。6、引物5'端可以修飾，3'端不可修飾引物5’端修飾包括：加酶切位點(diǎn)、加標(biāo)記熒光、引入突變序列、引入啟動(dòng)子序列等。優(yōu)先保證特異性1、引物自身不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，沒(méi)有連續(xù)的GC分布,2、引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，【再分析】當(dāng)溫度已經(jīng)設(shè)定準(zhǔn)確后，擴(kuò)增出的產(chǎn)物中仍有有一些錯(cuò)誤的片段，可能是什么原因?qū)е碌模靠赡茉颍?、引物失效2、引物特異性不高3、模板數(shù)量太多4、Mg2?缺失（或濃度不合適）5、產(chǎn)物被污染6、模板不純等原因①引物因自身存在互補(bǔ)區(qū)域或引物太長(zhǎng)或CG含量高而發(fā)生

局部堿基互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致引物失效。原因②引物之間因發(fā)生局部堿基互補(bǔ)配對(duì)而失效原因①引物太長(zhǎng)、太短，GC含量太高，導(dǎo)致其特異性不高；原因②引物與非目的擴(kuò)增區(qū)域相似度高，導(dǎo)致其特異性不高；原因③復(fù)性的溫度低，導(dǎo)致發(fā)生非特異性結(jié)合解決辦法：只要引物是過(guò)量的，模板與引物配對(duì)結(jié)合的概率就特別高，就能保證復(fù)性時(shí)是引物和模板鏈配對(duì)結(jié)合。解決辦法：嚴(yán)格進(jìn)行無(wú)菌操作對(duì)點(diǎn)訓(xùn)練1．（24-25高三上·江蘇泰州·開(kāi)學(xué)考試）黑水虻是重要的資源昆蟲(chóng)，體內(nèi)H基因編碼的抗菌肽HI-3具有抗菌、抗癌和免疫調(diào)節(jié)作用。科研人員利用酵母菌生產(chǎn)抗菌肽HI-3，并避免基因污染。請(qǐng)回答下列問(wèn)題：(1)利用PCR技術(shù)擴(kuò)增H基因，需根據(jù)H基因設(shè)計(jì)兩種引物，引物的作用有_________。A．為T(mén)aq酶提供結(jié)合位點(diǎn)B．決定擴(kuò)增產(chǎn)物大小C．決定反應(yīng)的特異性D．決定變性時(shí)間ABC【分析】PCR能不能無(wú)限循環(huán)下去？PCR不能無(wú)限進(jìn)行下去，主要原因包括

反應(yīng)成分消耗、酶活性下降、產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)抑制等因素。（1）反應(yīng)成分的消耗①dNTPs（脫氧核苷酸）耗盡；②引物耗盡（2）DNA聚合酶的失活原因：TaqDNA聚合酶在高溫（95°C）下會(huì)逐漸失活，即使使用熱穩(wěn)定酶，經(jīng)過(guò)

30-40輪循環(huán)后，酶活性也會(huì)顯著降低（因?yàn)闇囟葘?duì)酶的傷害會(huì)隨時(shí)間和溫度積累），影響擴(kuò)增效率。（3）產(chǎn)物競(jìng)爭(zhēng)抑制①產(chǎn)物積累抑制PCR，因?yàn)橐锔菀妆舜私Y(jié)合，而不是與模板結(jié)合。從而形成引物二聚體，使反應(yīng)體系中的引物被消耗，導(dǎo)致可用于目標(biāo)擴(kuò)增的引物減少或非特異性擴(kuò)增增加，降低目標(biāo)產(chǎn)物的比例。②產(chǎn)物重新結(jié)合，即：高濃度PCR產(chǎn)物在復(fù)性階段可能自身復(fù)性（而非與引物結(jié)合），阻礙新鏈的合成。限制循環(huán)數(shù)：一般不超過(guò)40個(gè)循環(huán)，避免進(jìn)入平臺(tái)期（產(chǎn)物抑制階段）。PCR的后續(xù)實(shí)驗(yàn)P79原文勾畫(huà)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定100bp200bp300bp400bp500bp600bp700bp800bp1,200bp1,000bp900bp標(biāo)準(zhǔn)