第一章發酵工程第一節eq\b\lc\|\rc\(\a\vs4\al\co1(,,,))傳統發酵技術的應用一、發酵與傳統發酵技術1.發酵的歷史約9000年前，我們的祖先就會利用微生物將谷物、水果等發酵成含酒精的飲料；1857年，法國微生物學家巴斯德通過實驗，證明酒精發酵是由活的酵母菌引起的。2.發酵（1）發酵概念發酵是指人們利用_微生物_，在_適宜_的條件下，將原料通過_微生物的代謝_轉化為人類所需要的產物的過程。（2）發酵原理不同的微生物具有產生不同代謝產物的能力，因此利用它們既可以生產出人們所需要的多種產物。（3）發酵類型好氧發酵：醋酸發酵厭氧發酵：酒精發酵、乳酸發酵3．腐乳的制作（1）參與的微生物：多種微生物參與了豆腐的發酵，如酵母、曲霉和毛霉等，其中起主要作用的是毛霉。（2）腐乳的特點：豆腐中的蛋白質被分解成小分子的肽和氨基酸，味道鮮美，易于消化吸收，便于保存。4．傳統發酵技術(1)概念：直接利用原材料中天然存在的微生物，或利用前一次發酵保存下來的面團、鹵汁等發酵物中的微生物進行發酵、制作食品的技術。(2)類型：傳統發酵以混合菌種的固體發酵及半固體發酵為主，通常是家庭式或作坊式的。(3)發酵產品：利用傳統發酵技術制作的食品有腐乳、醬、醬油、醋、泡菜和豆豉等。二、嘗試制作傳統發酵食品1.乳酸菌（1）分布廣泛：空氣、土壤、植物體表、人或動物的腸道內都有分布。（2）代謝類型：異養厭氧型。（3）常見種類：乳酸鏈球菌和乳酸桿菌。（4）制作原理①在無氧條件下，乳酸菌將葡萄糖分解為乳酸。可用于乳制品的發酵、泡菜的腌制等。②反應簡式：C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C3H6O3(乳酸)＋能量。2.酵母菌（1）代謝特點是一類_單細胞真菌_，是_兼性厭氧_微生物；在_無氧_的條件下能進行_酒精發酵_（2）重要影響因素__溫度__是影響酵母菌生長的重要因素；釀酒酵母的最適生長溫度約為_28℃_；（3）發酵原理（反應簡式）條件反應簡式目的有氧C6H12O6＋6H2O＋6O2eq\o(→,\s\up7(酶))6CO2＋12H2O＋能量大量繁殖無氧C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量酒精發酵（4）生產應用可用于_釀酒_、_制作饅頭和面包_等（5）分布在一些_含糖量較高_的_水果_、蔬菜表面_3.醋酸菌（1）代謝特點_好氧_細菌，代謝類型是異養需氧型；當_O2、糖源都充足時，能將_糖_分解為_醋酸_；當_缺少糖源_時則將_乙醇_轉化為_乙醛_，再將_乙醛_變為_醋酸；多數醋酸菌的最適生長溫度為_30-35℃_；（2）發酵原理（反應簡式）①氧氣、糖源都充足：醋酸菌能將糖分解成醋酸。反應簡式：C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up7(酶))2CH3COOH＋2H2O＋2CO2＋能量。②氧氣充足、缺少糖源：醋酸菌將乙醇轉化為乙醛，再將乙醛變為醋酸。反應簡式：C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up7(酶))CH3COOH＋H2O＋能量。（3）生產應用醋酸菌可用于制作各種風味的_醋_探究.實踐一：泡菜的制作1．發酵原理 (1)菌種：乳酸菌。 (2)原理：在無氧條件下，乳酸菌將葡萄糖分解成乳酸。 反應式：C6H12O6→2C3H6O3（乳酸）+能量2．實驗流程3．發酵條件 (1)選擇氣密性好的泡菜壇，以保證無氧條件。 (2)注意控制腌制時間、溫度和食鹽的用量。①選擇的泡菜壇要密封性好；②加入蔬菜后要注入煮沸冷卻的鹽水，使鹽水沒過全部菜料；③蓋上壇蓋后要在壇蓋邊沿的水槽中注滿清水。4．亞硝酸鹽含量的測定 (1)原理 亞硝酸鹽＋對氨基苯磺酸→反應物＋N-1-萘基乙二胺鹽酸鹽→玫瑰紅色染料 (2)方法：比色法。即用顯色反應后的樣品與已知濃度的標準顯色液進行對比，并估算泡菜中亞硝酸鹽的含量。亞硝酸鹽溶液的濃度越高，顏色越深；濃度越低，顏色越淺。 (3)操作步驟eq\x(配制溶液)→eq\x(制備標準顯色液)→eq\x(制備樣品處理液)→eq\x(比色)探究.實踐二：制作果酒和果醋制作果酒：1.參與發酵的主要微生物及來源：_新鮮水果的果皮表面附著的野生酵母菌；2.發酵原理①許多_新鮮水果的果皮表面__附著有大量的不同種類的__野生酵母菌_；②在這些酵母菌的作用下，水果可以發酵成果酒（通過有氧呼吸大量繁殖，通過無氧呼吸產酒精）；③相關反應式C6H12O6＋6H2O＋6O2eq\o(→,\s\up7(酶))6CO2＋12H2O＋能量C6H12O6eq\o(→,\s\up7(酶))2C2H5OH(酒精)＋2CO2＋能量3.發酵條件：①溫度：將溫度控制在_18-30℃_進行發酵；②氧氣含量：氧氣充足的情況下，_大量繁殖_；無氧條件下，進行_酒精發酵_；制作流程:器具消毒將發酵瓶、榨汁機等器具用洗潔精清洗干凈，并用器具消毒將發酵瓶、榨汁機等器具用洗潔精清洗干凈，并用體積分數為70%的酒精消毒，晾干備用取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次取新鮮葡萄，用清水沖洗1-2次，再去除枝梗和腐爛的籽粒，瀝干沖洗葡萄用榨汁機榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間用榨汁機榨取葡萄汁，將葡萄汁裝入發酵瓶（注意：要留有大約1/3的空間），蓋好瓶蓋榨汁裝瓶酒精發酵將溫度控制在酒精發酵將溫度控制在18-30℃進行發酵，在發酵過程中，每隔12h左右將瓶蓋擰松一點（注意：不是打開瓶蓋），此后再擰緊瓶蓋。發酵時間為10-12d.果酒檢測可通過果酒檢測可通過從發酵瓶口取樣來對發酵的情況進行檢測制作果醋：參與發酵的主要微生物及來源：_空氣中的醋酸菌或人工接種的醋酸菌_；發酵原理①在_有氧_的條件下，果酒經醋酸菌的作用可以進一步發酵成果醋；②當糖源充足時，醋酸菌還可以直接將糖分解為醋酸；③相關反應式C6H12O6＋2O2eq\o(→,\s\up7(酶))2CH3COOH＋2H2O＋2CO2＋能量。C2H5OH＋O2eq\o(→,\s\up7(酶))CH3COOH＋H2O＋能量。發酵條件：①溫度：發酵溫度為_30-35℃_；②氧氣含量：氧氣供應_充足_制作流程（以乙醇為底物的類型為例）果酒制作果酒制作當葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋當葡萄酒制作完成后，打開瓶蓋，蓋上一層紗布，進行葡萄醋的發酵。發酵溫度為30-35℃，時間為7-8d。打開瓶蓋，蓋上紗布果醋檢測果醋檢測第二節微生物的基本培養技術及應用一、微生物的基本培養技術1.微生物的定義：肉眼難以看清，需要借助光學顯微鏡或電子顯微鏡才能觀察到的一切微小生物的總稱。微生物菌落：分散的微生物在適宜的固體培養基表面或內部可以繁殖形成肉眼可見的、有一定形態結構的子細胞群體，這就是菌落。由單個微生物繁殖形成的純培養物就是一個單菌落；*一個單菌落就是一個種群。培養基的配制（1）概念：人們按照微生物對營養物質的不同需求，配制出的供其生長繁殖的營養基質。（2）培養基作用：培養、分離、鑒定、保存微生物或積累其代謝物（3）培養基類型： 按物理狀態可分為液體培養基和固體培養基。 按功能可分為選擇培養基和鑒別培養基。（4）成分：各種培養基一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽，此外還要滿足微生物生長對pH、特殊營養物質以及氧氣的要求。5.無菌技術（1）關鍵：防止外來雜菌的入侵。（2）無菌技術工作兩個方面：①對操作的_空間、操作者的_衣著_和_手_進行_清潔_和_消毒_；②對用于微生物培養的_器皿_、__接種用具__和__培養基_等進行__滅菌_；（3）無菌技術主要包括消毒和滅菌項目理化因素的作用強度能否消滅芽孢和孢子常用方法消毒較為溫和不能煮沸消毒法、巴氏消毒法、化學藥物消毒法、紫外線照射滅菌強烈能灼燒滅菌、干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌、濕熱滅菌法6.微生物的純培養（1）培養物：在微生物學中，將接種于_培養基_內，在_合適條件_下形成的__含特定種類微生物的群體_稱為培養物。（2）純培養物：由_單一個體_繁殖所獲得的_微生物群體_稱為純培養物。*單菌落一般是由單個微生物繁殖形成的純培養物。（3）純培養：__獲得純培養物的過程_就是純培養。（4）微生物純培養步驟：配制培養基—滅菌—接種—分離—培養。探究.實踐：酵母菌的純培養1.原理：采用_平板劃線法_和__稀釋涂布平板法_將_單個_微生物_分散_在_固體培養基_上，之后得到的_單菌落_一般是由單個微生物形成的_純培養物_。2.步驟（1）制備培養基：配制培養基—滅菌—倒平板（2）（2）接種和分離酵母菌：通過接種環在固體培養基表面連續劃線的操作，將聚集的菌種逐步稀釋分散到培養基表面。經過數次劃線后培養可以分離得到單菌落。（3）培養酵母菌：完成平板劃線后，待菌液被培養基吸收，將接種后的平板（一般做三組，重復實驗）和一個未接種的平板倒置，放入28℃左右（培養溫度因酵母菌種類的不同而稍有差異）的恒溫培養箱中培養24-48h。（4）實驗注意事項A.培養基滅菌后為什么要冷卻到50℃左右時開始倒平板？瓊脂是一種多糖，在44℃以下凝固，倒平板時，若低于50℃不及時操作，瓊脂會凝固。B.為什么倒平板和接種整個過程要在酒精燈火焰旁進行？避免雜菌污染C.倒平板時為什么要使錐形瓶的瓶口通過火焰？通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養基D.在倒平板的過程中，若不小心將培養基濺在皿蓋與皿底之間部位，這個平板還能用來培養微生物嗎？為什么？不能；因為空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養基上滋生E.平板冷凝后，為什么要將平板倒置？可避免培養基中的水分過快蒸發；可防止皿蓋上的水珠落入培養基，造成污染二、微生物的選擇培養基與計數1.選擇培養基：在微生物學中，_允許特定種類_的微生物生長，同時_抑制或阻止其他種類_微生物生長的培養基。2.微生物的選擇培養：（1）方法：_稀釋涂布平板法__；（2）方法概述：由于土壤細菌的數量龐大，要想得到特定微生物的純培養物，必須要對土壤進行_充分稀釋_，然后再將菌液_涂布_到制備好的_選擇培養基_上；兩個基本操作：_梯度稀釋_和_涂布平板_。（3）操作流程eq\x(土壤取樣)→eq\x(樣品稀釋)→eq\x(取樣接種)→eq\x(培養觀察)→eq\x(菌種鑒定)微生物的數量測定間接計數法(稀釋涂布平板法)直接計數法(顯微計數法)原理當樣品的稀釋度足夠高時，培養基表面生長的一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，通過統計平板上的菌落數，就能推測出樣品中大約含有多少活菌利用特定細菌計數板或血細胞計數板，在顯微鏡下計算一定容積的樣品中微生物的數量公式每克樣品中的菌落數＝eq\f(C,V)×M；C：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數；V：涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL)；M：稀釋倍數每毫升原液所含細菌數：每小格內平均細菌數×400×104×稀釋倍數缺點當兩個或多個菌體連在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落不能區分細胞死活結果比實際值偏小比實際值偏大探究.實踐：土壤中分解尿素的細菌的分離與計數(1)原理：分解尿素的細菌合成的脲酶將尿素分解為氨，使培養基的堿性增強。(2)方法：在以尿素為唯一氮源的培養基中加入酚紅指示劑，培養某種細菌，若指示劑變紅，可初步鑒定該種細菌能夠分解尿素。4.兩種純培養方法對比比較項目平板劃線法稀釋涂布平板法關鍵操作接種環在固體培養基表面連續劃線①一系列的梯度稀釋②涂布平板操作注意事項每次劃線前后均需灼燒接種環稀釋度要足夠高，為確保實驗成功可以增加稀釋度的范圍菌體獲取在具有顯著的菌落特征的區域挑取菌體從適宜稀釋度的平板上的菌落中挑取菌體適用范圍適用于好氧菌適用于厭氧菌和兼性厭氧菌優點可以根據菌落的特點獲得某種微生物的單細胞菌落既可以獲得單細胞菌落，又能對微生物計數缺點不能對微生物計數操作復雜，需要涂布多個平板第三節發酵工程及其應用一、發酵工程的基本環節選育菌種（1）目的：獲得_性狀優良的菌種__（2）菌種來源：從自然界中篩選、_誘變育種__或__基因工程育種__。（3）實例：篩選產酸量高的黑曲霉用來生產檸檬酸；使用基因工程改造的啤酒酵母，加速發酵、縮短生產周期；優良的菌種不僅具有健壯，不易退化，其發酵產品的產量高、質量穩定等優點，它往往還會賦予發酵產品獨特的風味，因此菌種選育環節在很大程度上決定了生物發酵產物的成敗。2.擴大培養（1）目的：獲得_更多的菌種_。（2）原因：工業發酵罐的體積一般為幾十到幾百立方米，接入的菌種總體積需要幾立方米到幾十立方米。所以，在發酵之前還需要對菌種進行擴大培養。3.配制培養基①在菌種確定之后，要_選擇原料__制備培養基。②在生產實踐中，培養基的配方要經過_反復試驗__才能確定。4.滅菌（1）滅菌原因：發酵工程種所用的菌種大多是_單一菌種_，一旦有雜菌污染，可能導致_產量大大降低_。（2）_培養基和發酵設備__都必須經過嚴格的滅菌；5.接種將_擴大培養后_的菌種投放到_發酵罐_中。6.發酵罐內發酵——（發酵工程的中心環節）（1）要求：①發酵過程中，要_隨時檢測_培養液中_微生物數量_、_產物濃度_等，以__了解發酵進程__；②要及時添加_必需的營養物質_，要嚴格控制_溫度_、__pH_和__溶氧量_等發酵條件。（2）嚴格控制發酵條件的原因：①環境條件不僅會影響微生物的生長繁殖，而且影響微生物代謝物的形成；②嚴格控制發酵條件，有利于使發酵全過程處于最佳狀態。（3）不同發酵條件的影響實例——谷氨酸發酵①在_中性_和__弱堿性__條件下會積累谷氨酸；②在_酸性__條件下則容易生成谷氨酰胺和N-乙酰谷胺酰胺。（4）現代發酵工程使用的發酵罐的優點：均有_計算機控制系統__，能對發酵過程中的溫度、pH、溶氧量、罐壓、通氣量、攪拌、泡沫和營養等進行_監測_和_