細胞工程實驗指導

（本科生用）

目錄

第一部分實驗室規章制度..............................1

學生實驗守則................................................1

實驗室安全管理制度..........................................1

第二部分細胞工程基本實驗室技術.....................3

一、清洗與包裝.............................................3

二、消毒滅菌................................................5

三、無菌操作................................................9

四、實驗室維持.............................................10

第三部分實驗項目...................................12

實驗一、動物細胞工程常用培養液配制與檢測................12

實驗二、小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運動能力檢測

與結構觀察.......................................17

實驗三、小鼠輸卵管卵母細胞采集與結構觀察................20

實驗四、小鼠超數排卵及附植前不同發育階段胚胎采集與結構觀察

..................................................................................................25

實驗五、小鼠組織細胞原代培養............................29

實驗六、小鼠組織細胞傳代培養.............................32

實驗七小鼠胎兒成纖維細胞活性檢測.......................34

實驗八、體外培養細胞生長曲線測定........................36

實驗九、小鼠卵母細胞體外受精.............................39

實驗十小鼠胚胎體外培養41

實驗十一植物培養基的配制...............................43

實驗十二植物材料的初代培養.............................48

實驗十三花粉發育時期的鑒定.............................51

實驗十四植物離體培養物的形態觀察.......................54

實驗十五植物莖尖生長點、胚胎及花器官的剝離與觀察......56

實驗十六植物離體根與植物細胞的液體培養................60

實驗十七植物離體培養物的繼代培養與生根培養............64

實驗十八植物原生質體的分離、純化與培養..................67

實驗十九植物花藥的離體培養.............................70

第四部分部分實驗項目流程簡圖......................72

常用培養液配制與檢測......................................72

小鼠精子采集與結構觀察....................................73

小鼠超數排卵、卵母細胞及附植前胚胎結構觀察................74

小鼠體外受精與胚胎體外培養...............................75

小鼠胎兒成纖維細胞原代培養、傳代培養......................76

細胞活性檢測、生長曲線測定...............................76

第五部分附錄：實驗小鼠的特性及飼養管理............77

一、小鼠的生物學特性......................................77

二、小鼠的習性.............................................78

三、小鼠生殖系統解剖.......................................78

四、小鼠的生殖生理學特點...................................80

五、小鼠的飼養管理.........................................83

ii

第一部分實驗室規章制度

學生實驗守則

一、實驗前必須預習實驗教材，明確實驗原理、目的、要求、方法及步

驟，熟悉所用儀器設備的性能及操作規程，作好實驗準備。

二、進入實驗室，要嚴格遵守實驗室各項規章制度，衣著及所攜帶物品

符合實驗要求，按規定位置就位。

三、保持室內安靜、整潔，不隨地吐痰，不亂扔紙屑、亂倒廢物及實驗

產生的廢料，不高聲喧嘩，嚴肅自律，不影響他人實驗。

四、實驗時要遵從老師指導，遵守操作規程，認真操作，仔細觀察，積

極思考，努力培養自己分析問題和解決問題的能力。

五、如實記錄實驗數據，分析實驗現象，不抄襲他人實驗記錄，做完實

驗認真復查，如有錯漏，及時更正或補做。

六、要愛護儀器設備，節約水、電、試劑、藥品和器材。凡損壞或丟失

儀器、材料、工具等，均應及時報告并登記，按規定處理。

七、實驗結束要整理實驗臺面，收拾實驗儀器、器材，打掃衛生。離開

實驗室時，要注意切斷電源、水源、氣源，經許可方可離開。

八、按時完成實驗報告，認真做好實驗后的復習和總結，真正掌握所學

知識。

實驗室安全管理制度

一、實驗室對所有實驗人員及學生進行安全教育，牢固樹立安全意識。

根據本室設備、環境及實驗特點，制定防火、防爆、防盜、防事故等方面安

全管理措施，嚴格執行。

二、儀器室、重點要害部位及使用、存放易燃、易爆物及危險品的場所

要重點防護，安全措施到位，必要時設置安全監控預警系統。

三、從事生物安全相關的實驗要嚴格按照國家的有關規定進行，在實驗

中嚴格控制，防止病原微生物及其污染物的擴散，嚴格制定人員及環境保護

措施，并定期檢查，出現問題及時上報上級主管部門。

四、室內水電、管線設施必須按要求裝配，不準亂接亂拉，隨意拆裝、

改線。各類在用設備應保持完好安全狀態，有溝、坑、井、臺、洞的地方，

應設蓋板、護欄、警示牌。

五、實驗室必須配備符合規定的消防器材，放置于明顯位置，專人負責

管理，定期檢查，確保有效可用。

六、實驗室鑰匙有專人管理，不得私自配備或轉借他人。工作人員離開

實驗室前，必須關好門、窗、水、電、氣等，保管好貴重物品。節假日前，

要對實驗室進行全面安全檢查，假期有值班，假后復查，確保安全。

七、各實驗室要定期進行安全檢查，發現不安全隱患，及時排除；不能

自行排除的，報告有關部門處理。如發生事故，應及時采取措施，如實報告

案情。凡隱瞞不報，造成重大損失的，將追究其責任。

2

第二部分細胞工程基本實驗室技術

細胞工程操作是基于無菌條件下進行的，需要建立一套滿足無菌操作技術

和無菌培養的環境。可以通過無菌操作過程獲得動物組織、器官和細胞等無菌

培養物，并在適宜環境條件下生長、發育、繁殖。動物配子及胚胎的體外操作

也需要在相當嚴格的無菌條件下進行，才能獲得諸如胚胎移植、胚胎體外生產、

克隆動物等胚胎工程研究和應用的成功。

細胞工程的操作對象，對操作器具帶來的毒性非常敏感，體外培養中任何

與培養物相接觸的有害物質都會影響培養物的體外生長和增殖，諸如微生物、

細胞碎片以及非營養性化學物質等都可能干擾正常的實驗結果。培養工作開始

之前，對實驗室所使用的培養器具進行徹底清洗、滅菌，清除可能殘存的細胞

毒性物質；即使不進行培養時，培養物操作器械、物品，也應按照這些要求清

洗，消毒、滅菌。動物細胞工程實驗室基本操作技術主要包括清洗、消毒滅菌、

無菌操作及實驗室維持等基本環節。該項操作技術雖然簡單，但要求仔細耐心。

它對保證實驗的成功十分重要。所以，應力求通過各項操作步驟，使實驗物品

保持無菌狀態，滿足實驗最基本要求。

一、清洗與包裝

（一）物品清洗

新的或用后的各種器皿，包括玻璃器皿、塑料器皿、金屬器械、除菌濾器

等都應嚴格清洗。

新購置的玻璃器皿，常有游離堿性物質，并附有一些對細胞和胚胎培養有

害的物質，如有害金屬及灰塵等，因此，新的玻璃器皿在使用前應徹底清洗并

經過一定的化學處理。村先在清水中沖洗，晾十水分后在洗液中浸泡過夜，再

經流水沖洗6小時以上c必要時，還需經1%鹽酸溶液浸泡數小時，再用流水沖

洗數小時，經蒸儲水漂洗3次以上，最后用重蒸餛水或去離子水漂洗2次，60℃

烘干備用。已用過的玻漓器皿用洗滌劑刷洗，刷洗時用力要輕，防止損傷器皿

表面或造成劃痕，或用超聲波清洗儀清洗，清洗后用流水沖洗數小時，經蒸儲

水漂洗3次以上，最后用多重蒸播水或去離子水漂洗2次，烘干備用。

新的已滅菌的塑料器皿打開即可以使用。己用過的塑料器皿應先用清水充

3

分浸泡，或超聲波清洗儀清洗，沖洗干凈，再用2%NaOH溶液浸泡過夜，流水

沖洗數小時，然后用1%稀鹽酸浸泡數小時，流水沖洗數小時，最后用蒸儲水漂

洗3次，多重蒸儲水或去離子水漂洗2次，晾干后備用。

新的金屬器皿用熱洗滌劑溶液洗凈，再用清水沖洗，擦干即可。

培養器皿已受微生物污染時，先用高壓蒸汽滅菌后清洗。需重復使用的除

菌濾器用清水沖洗后，用洗液沖洗，硫酸抽濾清洗，再用清水沖洗，之后用蒸

儲水連續抽濾沖洗，最后用多重蒸儲水連續抽濾沖洗，烘干備用。

應以耐酸、耐熱、開口較大的容器盛裝洗液。可根據需要選用不同強度的

洗液（表2—1）,配制洗液的方法是：①按照上述配方，將需要量的重銘酸鉀和

蒸儲水加到選用的容器內；②向容器內緩慢、分次加入濃硫酸（工業硫酸即可），

輕輕攪拌溶液，以加快散熱及促進重輅酸鉀溶解。加入濃硫酸時切勿過急，以

免液體驟熱，發生危險；③自然冷卻。

表2-1洗液配方

成分強酸溶液次強酸溶液弱酸溶液常用配方

重銘酸鉀（g）60100501(X)

濃硫酸（mL）800200100200

蒸儲水（mL）20010001000800

新配制的洗液呈棕紅色。配制和使用洗液時，操作者須戴耐酸手套。浸酸

的器具一定要晾干，以免將水分帶入洗液而使其效力下降。放入器皿或浸酸后

取出器皿時，須小心操作，防止液體濺出，傷及操作者皮膚或衣服。將器皿從

洗液中取出時，應滴干洗液。當洗液的顏色變暗、發綠或渾濁時，說明已使用

過久，效力降低，應重新配制。

（二）清洗后物品的包裝

洗凈烘（晾）干的物品應及時包裝，以備消毒滅菌。包裝的物品也便于消毒滅

菌和貯存，同時可防止消毒滅菌后再受污染。包裝常用硫酸紙、牛皮紙、紗布、

棉布、錫箔紙、鋁盒、飯盒、專用金屬消毒筒等。包裝的方式根據消毒滅菌的

方法而有所不同。

對于體積較大的器皿（如大燒杯、燒瓶等）及濾器等容器，可采用局部包裝的

方法。把開口部分用硫酸紙及牛皮紙或棉布等兩層緊密包裝，包好后用棉線繩扎

緊。對于較小的器川I，如培養川I、玻璃吸管、注射器、膠塞等可以用硫酸紙及牛

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皮紙等兩層整體包裝；金屬器械、棉塞等可以先裝入鋁盒、飯盒或消毒筒中，然

后用棉布全部包裹起來；手術器械、手套、工作衣等可以用布直接包裹。一般全

包裝物品體積不能過大，可以用線繩捆扎，但不可太緊。放有物品的鋁盒、飯盒

或消毒筒等的底部和四周需要有多處通氣孔，盒蓋或筒蓋不宜過緊。多個相同容

器不易辨別時，應分別注明內裝用品的名稱，每一容器內的用品不宜放置過多、

過密。注射器的針筒和針芯要分開并一起包裝。吸管包裝盒的底部墊一些脫脂棉

或軟紙、紗布，管口放入少許脫脂棉或紗布，包裝松緊適宜，以免吸管頭被撞斷。

二、消毒滅菌

嚴格的消毒滅菌對細胞與胚胎工程研究與應用工作極為重要，直接影響著整

個實驗能否順利進行。

（一）消毒滅菌方法

目前常用的消毒滅菌方法多采用物理方法（如干熱滅菌法、濕熱滅菌法、過

濾除菌法、射線殺菌法等）和化學方法（消毒劑、抗生素）兩大類。

1.干熱滅菌法

是利用恒溫干燥箱內120°C?150（的高熱，并保持90?120min,殺死細菌

和芽抱，達到滅菌目的的一種方法。主要適用于不便在壓力蒸汽滅菌器中進行滅

菌，且不易被高溫損壞的玻璃器皿、金屬器械以及不能和蒸汽接觸的物品的滅菌。

用此方法滅菌的物品干燥，易于貯存。酒精燈火焰燒灼滅菌法也是屬于干熱滅菌

的方法之一，在進行動物細胞體外培養工作時，常須利用工作臺面上的酒精燈火

焰對金屬器具及玻璃器皿口緣進行補充滅菌。

2.濕熱滅菌法

壓力蒸汽濕熱滅菌法是目前最常用的一種滅菌方法。它利用高壓蒸汽以及在

蒸汽環境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質凝固變性而使微生物

死亡。適合于布類工作衣、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸儲水、棉塞、紙和某

些培養液的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調整為1.0?1.1kg/cn?,維持

20?30min即可達到滅菌效果。飽和蒸汽壓力與其對應的溫度見表2—2。

3.射線滅菌法

利用紫外線燈進行照射滅菌的方法。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以

殺滅多種微生物。紫外線的作用機制是通過對微生物的核酸及蛋白質等的破壞作

5

用而使其滅活。適合于實驗室空氣、地面、操作臺面滅菌。滅菌時間為30min。

用紫外線殺菌時應注意，不能邊照射邊進行實驗操作，因為紫外線不僅對人體皮

膚有傷害，而且對培養物及一些試劑等也會產生不良影響。

表2-2飽和蒸汽壓力與其對應的溫度

飽和蒸汽壓力溫度飽和蒸汽壓力溫度

kg/cm1b/in2(℃)kg/cm1b/in2(℃)

0.001001.05515121.0

0.1412103.61.12516122.()

0.2814106.91.26618124.1

0.4426109.81.40620126.0

0.5638112.61.54322127.8

0.70310115.21.68124129.6

0.84412117.630134.5

0.98414119.950147.6

(引自周維燕,1999)

4.過濾除菌法

是將液體或氣體通過有微孔的濾膜過濾，使大于濾膜孔徑的細菌等微生物

顆粒阻留，從而達到除菌的方法。過濾除菌法大多用于遇熱易發生分解、變性

而失效的試劑、醐液、血清、培養液等。目前\常用微孔濾膜金屬濾器或塑料

濾器正壓過濾除菌，或用玻璃細菌濾器、濾球負壓過濾除菌。濾膜孔徑應在0.22?

0.45岬范圍內或用更小的細菌濾膜，溶液通過濾膜后，細菌和胞子等因大于濾

膜孔徑而被阻，并利用濾膜的吸附作用，阻制小于濾膜孔徑的細菌透過c

5.化學消毒劑消毒法

用于那些不能利用物理方法進行滅菌的物品、空氣、工作面、操作者皮膚、

某些實驗器皿等。常用的化學消毒劑包括甲醛、高鎰酸鉀、70%?75%乙醇、過

氯乙酸、來蘇爾水、0.1%新潔爾滅、環氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%?

75%乙醇、0.1%?0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白粉等進行實驗材料的滅

菌；利用甲醛加高鋅酸鉀［(2mL甲醛+1g高鋅酸鉀)/m3］或乙二醇(6mL/n?)等加

熱熏蒸法進行無菌室和培養室的消毒。在使用時應注意安全，特別是用在皮膚

或實驗材料上的消毒劑，須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時間，才能達到

安全和滅菌的目的。

6.抗生素抑菌法

6

主要用于培養液，是培養過程中預防微生物污染的重要手段以及作為微生

物污染不嚴重時的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、鏈霉素和新霉素等。

（二）不同種類物品及培養物的消毒滅菌方法

1.無菌操作室滅菌

培養材料進行培養、觀察或更換培養液時，必須從各方面防止任何污染物

進入培養液或容器，所以無菌操作室的滅菌是至關重要的。由于無菌操作室的

污染來源主要是空氣中的細菌和真菌徇子，因此長期停用后的無菌操作室應進

行熏蒸滅菌，熏蒸是用高鎰酸鉀+甲醛［（2mL甲醛+1g高鎰酸鉀）/n?］進行無菌室

的滅菌。經常使用的無菌操作室，在每次使用前都應進行地面衛生清潔，并用

紫外線燈照射30min,進行空氣滅菌。對超凈工作臺，每次操作前用紫外燈照

射30min,然后用70%?75%酒精擦拭。

2.培養液滅菌

培養液在制備過程中帶有各種雜菌，分裝后應立即滅菌，或在24小時內完

成滅菌工序。目前常用過濾除菌法除去培養物操作液和培養液中的細菌。或對

培養液中耐熱組分先進行高壓蒸汽滅菌，然后在無菌室加入經過過濾除菌的不

耐熱溶液，混勻后分裝備用。

使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時，將分裝好的培養液放入底部有一定量（淹沒

加熱管）涼水的高壓蒸汽滅菌器內，增壓至0.35?0.4kg/cn?時排凈滅菌器內冷

空氣，以便使蒸汽能到達各個消毒部位，保證消毒滅菌徹底。然后繼續加壓加

熱，當壓力表讀數達到1.0T.1kg/cn?為12FC,保持15?20min即可。由于消

毒滅菌效果取決于溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長的消毒滅菌時

間是必須的。在121（的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細菌及高度耐熱的芽泡

桿菌，因此許多培養液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在1.0?1.1kg/cm\121℃o

消毒滅菌時間與需要消毒滅菌的培養液量密切相關（表2-3）,時間不足達不到滅

菌效果，時間過長培養液內的一些化學物質遭到破壞，影響培養液成分。消毒

滅菌結束后，關閉熱源，只有當滅菌器內壓力降為零時才能打開放氣閥，排除

剩余蒸汽，取出培養液。不可在壓力較高時打開放氣閥，引起減壓沸騰，使容

器中液體溢出。

培養液組成中如含有遇熱易分解的物質，則需用過濾方法消毒滅菌。首先

對培養液中耐熱組分進行高壓蒸汽滅菌后放置在無菌場所，固體培養液在40℃

7

左右瓊脂即將凝結前，加入經過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻后冷卻備用。液

體培養液在冷卻到室溫后再加入過濾除菌溶液。過濾除菌時，使用孔徑為0.22?

0.45國力或更小的細菌濾膜。過濾除菌可利用抽濾裝置或注射過濾器進行，所用

器皿均應進行高壓消毒滅菌，溫度不應超過12PC。

表2-3培養液高壓蒸汽滅菌所必需的最少時間

容器容積在12『C下所需的容器容積在12PC下所需的

(mL)最少消毒滅菌時間(min)(mL)最少消毒滅菌時間(min)

20?5015100030

7520150035

250?50025200040

(引自李浚明，1992)

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌

玻璃器皿可進行干熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌后最好及時烘干

水分。對不能進行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在無菌

操作臺面上晾干的同時"用紫外線重復殺菌。實驗室還可以用環氧乙烷滅菌袋

對塑料器皿進行消毒，消毒后的器皿要充分散氣2?4h后才可使用。無菌操作

所用的各種器械，一般采用干熱或高壓蒸汽滅菌，或用75%酒精浸泡，然后在

無菌操作臺面上晾干的同時再用紫外線重復殺菌；在使用期間可多次對其進行

酒精燈火焰灼燒滅菌。常用消毒劑消毒滅菌效果比較見表2-4o

表2-4常用消毒劑消毒滅菌效果比較表

消毒劑使用濃度(％)去除的難易消毒時間(min)效果

次氯酸鈣9-10易5?3()很好

次氯酸鈉2易5?30很好

漂白粉飽和溶液易5?30很好

濱水1?2易2?10很好

過氧化氫10?12最易5?15好

升汞().1?1較難2?1()最好

酒精70?75易0.2-2好

抗菌素4~5(mg/L)中30?60較好

硝酸銀1較難5?30好

(引自曹孜義，1999)

4.培養材料的消毒滅菌

采自動物機體的實驗材料，攜帶著微生物及雜質，接種前須進行表面消

8

毒滅菌，對內部已受微生物侵染的材料應予以淘汰。從動物機體采集的某些

組織塊，須用消毒劑進行浸泡處理，進行表面消毒。常用消毒劑有過氧化氫

（10%?12%,浸泡5?15min）、過氧乙酸（0.05%,浸泡30s~lmin）、酒精

（70%?75%,浸泡2min）。動物細胞工程實驗中常用物品的消毒滅菌方法選

擇見表2-5o

表2-5動物細胞與胚胎工程實驗中常用物品的消毒滅菌方法選擇

消毒滅菌物品壓力蒸汽干熱過濾紫外線化學氣體化學消毒劑

培養室、工作臺+++

玻璃制品++

金屬器械+十+

塑料制品++

橡膠制品+++

培養液+4-

棉、布類十+

培養物+

三、無菌操作

（-）無菌操作前的準備工作

培養材料接種時的無菌操作過程除上述各項消毒滅菌操作外，還需完成以

下無菌操作步驟，從而獲得接種的無菌培養材料。

工作人員無菌操作前需用肥皂刷洗雙手及手臂，并用流水沖凈，并對手臂

消毒后穿戴好滅菌工作服、工作帽和口罩，更換拖鞋，才能進入無菌操作區。

如進入層流操作室進行實驗操作，應完成緩沖準備區內的淋浴、一次更換滅菌

衣帽、拖鞋；手臂消毒、二次更換滅菌防護衣帽、手套、拖鞋等；再在風淋區

進行無菌風淋后方可進入層流操作室。進入無菌操作區后，再用70%?75%的

灑精擦拭雙手和前臂，完成無菌操作準備工作.

用70%?75%酒精擦洗工作臺面后，將已消毒滅菌的實驗用品取出，并將

操作器械放置在無菌器械支架上，然后開始實驗操作。在實驗操作過程中，對

所有操作器械每次使用后都要進行滅菌，常采用酒精燈火焰灼燒滅菌。

（二）無菌操作步驟

準備工作完成后，對來自于自然生長條件下的外植體，按上述培養材料消

9

毒方法滅菌后取出，放入己滅菌的培養皿中，然后置超凈工作臺酒精燈火焰下

方，用滅菌剪刀等器械進行適當分離、切割或其它處理后備用。在酒精燈火焰

處將培養容器的瓶塞（蓋）輕輕打開，瓶口在燈焰處旋轉灼燒，用躡子將培養材料

置入培養液上，將鐐子在酒精瓶中浸蘸酒精，置酒精燈上灼燒后放回支架，然

后迅速灼燎瓶塞（蓋）數秒后塞回瓶口。對繼代培養材料的無菌操作，需在燈焰處

打開瓶塞（蓋），繼代材料為液體培養細胞時直接用滅菌吸管吸取培養細胞液放入

新培養液中；繼代材料為固體培養細胞時用滅菌鏡子挑取適量材料置新培養液

上；繼代材料為其他組織時，用滅菌剪刀或其他器械進行培養材料適當切割后,

用滅菌鐐子將其置于新培養液上（中），然后迅速灼燎瓶塞（蓋）數秒后塞回瓶口。

（三）污染源及其表現特征

當培養材料、轉接器皿、無菌操作環境等消毒滅菌不徹底時，培養材料則

攜帶有微生物（microorganism）,當其被轉接到營養豐富的培養液上時，微生物繁

殖迅速，出現各種污染菌斑。微生物生長時分泌出對動物組織有毒的代謝廢物,

致使培養材料死亡或失去使用價值。在培養過程中，培養材料附近出現黏液或

混濁的水跡，并有發酵狀泡沫，這是細菌性污染。在細菌性污染中，特別要注

意一種呈乳白色的芽抱桿菌污染，它可出現在培養液表面，或呈滴形云霧狀存

在于培養液內，若出現應嚴格滅菌。而培養液表面出現的黃色、白色、黑色等

不同顏色的霉菌，這是真菌性污染c

四、實驗室維持

實驗室的日常維持是動物細胞工程實驗室所必須進行的。在實驗室工作的

每一位研究人員都應該被安排在一定范圍內承擔實驗室維持工作任務，以便使

實驗室保持在一個好的工作狀態和工作秩序。首先，進入實驗室時，應該保持

實驗室的整潔、干凈和整齊，一旦混亂就容易造成污染隱患。一個實驗室的維

持工作最好是有常用實驗室的實驗人員共同承擔，給每個人指定如離心機、抽

屜、培養箱等實驗區域的維持任務。如果有很多人在實驗室工作，更有效的方

法是列出值日表，明確每個人的任務。

（一）實驗室日維持任務

進入實驗室工作的所有人員，在每天進行實驗工作的前、后，用適當的消

1()

毒劑，如70%乙醇進行擦拭。廢物容器和廢液體應帶出細胞培養室，并在每天

工作完成后將其清除。如果有任何污染培養物需要廢棄，應立刻從培養室移出，

并進行高壓蒸汽滅菌處理。按照生物安全條例，細胞培養廢物應作為生物危害

處理，含有細胞的干廢物應放置在生物安全袋并進行高壓蒸汽滅菌處理，液體

廢物應使用或消毒劑進行消毒處理。如果任何液體灑在了儀器、垃圾或地板上,

應立即進行清潔并立即消毒。每次使用前后應進行紫外線殺菌處理，但不要通

宵開啟送風設備和殺菌燈。每天工作結束后，關閉顯微鏡、細胞計數儀及其他

應該關閉的儀器設備。檢查培養箱的溫度和CS指示。最后離開的人員應重新

檢查一遍上述工作是否完成。

（二）實驗室周維持任務

每周應該檢查一次所有液氮儲存罐的液氮面高度。檢查培養箱濕度盤的水

量。補充無菌貯藏柜的物品。無血清培養時，應及時訂購生長因子、激素及其

他所需的化學試劑，最好在冰箱或冷藏柜外面貼上這些化學物的列表。

（三）實驗室月維持任務

實驗室月維持任務很少經常進行，但至少應該定期進行一次。每月應進行

一次室內清潔，包括地板及天花等，要求用新的抹布和新鮮溶液進行地板清潔。

拆解培養箱，對各個培養室部件進行消毒；進行培養箱溫度和CO2水平的校正,

如果具有自動調零功能，至少應1年1次，最好半年1次。進行工作臺面的清

洗和徹底消毒。檢查所有移液管的精確度。檢查細胞計數儀，檢查清潔純水器

或更換過濾單位。清潔離心機、冷凍儀。檢查棄除過期液體。仔細檢查冰箱貯

存液體有無霉菌生長。清潔、檢查和整理顯微鏡。

II

第三部分實驗項目

實驗一動物細胞工程常用培養液配制與檢測

一、實驗目的

本實驗要求學生掌握動物細胞工程液體配制的準備工作，學習干熱滅菌和

高壓蒸汽滅菌的程序和方法；掌握常用操作液及基礎培養液的基本配制和質量

檢測方法；為動物組織、細胞、配子和胚胎的操作做好基礎準備。

二、實驗原理

動物細胞工程的主要操作對象是離體條件下動物有機體的各部分組織、器

官或細胞，這些用來進行離體培養的組織或器官稱為外植體；動物胚胎工程的

主要操作對象是配子和胚胎。要滿足操作對象在離體條件下正常生存和生長發

育，就必須為其提供適宜生長發育的良好營養條件，即培養液條件。動物的細

胞、組織、配子或胚胎在營養代謝、生長發育等多方面相比較，存在著諸多差

異，營養需求也不盡相同。所以在進行動物組織、細胞及配子、胚胎的離體操

作或培養時，需要配制不同的操作液或培養液。因此，了解培養液的組成與掌

握其配制方法是動物細胞工程研究與實驗的一項基本任務。

由于動物細胞工程操作對象的特點，常用操作液及培養液一般配制為液體

狀態。操作液及培養液中一些成分在溶液中不穩定，配制時一般先將液體的最

基本成分配成基礎液，使用前將這些成分作為添加成分加入基礎液最終配制成

操作液及培養液，不同的培養液及不同的實驗室在添加這些成分時采用的方式

有所不同。

動物細胞工程的操作是基于無菌條件下進行的，需要建立一套滿足無菌操

作技術和無菌培養的環境，配制無菌的液體為最基本的條件。而液體在制備過

程中往往帶有各種雜菌，配制成液體后應立即滅菌，或在24h內完成滅菌工序。

由于動物細胞工程操作液和培養液組成成分中常含有遇熱易分解的物質，所以

多采用過濾方法除去操作液和培養液中的細菌，并在過濾除菌時完成分裝。

為了檢驗配制的液體是否仍有細菌污染，配制成的液體應間隔一定時間進

行檢查，如顏色是否變化、是否發生渾濁以及是否有菌落出現等，如有必要可

12

進行培養檢查。

三、實驗材料和用具

教材或講義中實驗室配置部分已涉及到的不需要專門準備的固定儀器設備

和物品不再列出，在此列出需要在本實驗前檢查、調試、準備的儀器設備、器

械物品、藥品、試劑。

實驗者用品：工作服，帽子，口罩，拖鞋，把皂，手消毒桶及消毒液，75%

乙醇，酒精噴壺。

清洗用品：洗滌劑，水桶，水盆，瓶刷，試管刷，超聲波清洗儀，蒸鐳水

（一蒸水和二蒸水），塑料籃或不銹鋼籃，控水架，干燥箱。

消毒、滅菌用品：電爐，高壓蒸汽滅菌器，鼓風干燥箱，紗布，棉布，牛

皮紙，硫酸紙，棉繩，鋁盒，飯盒，酒精燈，火柴，酒精棉球°

液體配制用品：超凈工作臺，精密電子天平，藥匙，稱量紙，燒杯（HMOmL、

500mL.100mL）,放水瓶，四蒸水或超純水，玻璃棒，吸水紙，滴瓶，滴管，

量筒，注射器，移液器，移液器吸頭，吸頭盒，移液器架，漏斗，容量瓶（1000

mL、500mL.100mL）,蒸饋水（三蒸水或四蒸水）或超純水，磁力攪拌器，

酸度計及精密pH試紙，針頭濾器及濾膜，玻璃瓶，瓶塞，封口膜，標簽紙，剪

刀，膠布，記號筆。

藥品、試劑：1mol/LNaOH,1mol/LHCl,本實驗指導各液體配方成分。

四、實驗方法

（一）液體配制的準備

1.儀器設備的檢查調試

液體配制涉及的儀器設備，如高壓蒸汽滅菌器、鼓風干燥箱、精密電子天

平、超凈工作臺等，在使用前按照說明書，在工作狀態下進行檢查、調試。

2.物品洗滌及消毒滅菌

按照第二部分介紹的清洗程序，將與液體及其成分接觸的物品清洗干凈、

蒸儲水漂洗后，60c烘干。用于藥品試劑溶解、混合、定容的器皿即可使用。

用于液體無菌處理和分裝的器皿及物品進行包裝，耐高溫的器皿及物品采用恒

溫鼓風干燥箱進行干熱滅菌；不耐高溫的物品采用高壓蒸汽滅菌器進行濕熱滅

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菌，濕熱滅菌的物品應再烘干。

(二)常用操作液及培養液的配制

以實驗項目中常用的操作液和培養液為例，介紹液體配制方法。

1.無Ca*、無Mg-磷酸鹽緩沖液[PBS(-)]

無Ca"、無Mg"磷酸鹽緩沖液(phosphatebuffersolution,PBS)常用作細胞培

養的操作液。配制方法為，稱量NaCl10.0g,KC10.25g,Na2HPO4-12H2O1.44

g,KH2PO40.25g,四蒸水500mL,燒杯內磁力攪拌充分溶解，1000mL容量

瓶定容，分裝，15磅高壓蒸汽滅菌30min,4℃冰箱保存。

2.0.25%胰蛋白酶細胞消化液

胰蛋白酶0.25g,EDTA0.04g,PBS(?)液100mL,燒杯內磁力攪拌充分溶

解，0.22um濾膜正壓過濾，4mL/瓶分裝，-20C冰箱保存。

3.DMEM細胞培養液

DMEM液(dulbicco,sminimalessentialmedium)主要用于細胞培養。稱量高糖

DMEM粉13.4g,NaHCCh3.7g,分別加四蒸水300mL,磁力攪拌充分溶解，

再將NaHCCh溶液緩慢加入DMEM液中，1000mL容量瓶定容，調pH7.2,加

血清110mL,80U/mL青霉素，100U/mL鏈霉素，0.22um濾膜正壓過濾，

分裝，4℃冰箱保存。

4.改良杜氏磷酸鹽緩沖液(mPBS)

改良杜氏磷酸鹽緩沖液(modifiedphoaphatebuffersolution,mPBS)俵3—

1)常用作胚胎回收的操作液(沖卵液)。配制過程：

表37改良杜氏磷酸鹽緩沖液成分

成分分子量含量(mmol)稱量(mg/L)

NaCl58.44136.898000

KC174.652.68200

Na.HPO,141.968.091150

KH2P(X136.091.47200

A液前萄糖180.165.561000

丙酎酸鈉110.050.3336

青霉素70

鏈霉素50

牛血清白蛋白3000

B液CaCL110.990.90100

C液MgCL.6H：0203.310.49100

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①分別制備A、B、C三種溶液，三蒸水量加至最終量的80%,置冰箱冷藏

室中冷卻后依次混合，可防止沉淀，然后用容量瓶定容至1000mLo為了指示

pH值，可加入酚紅，但它不是PBS的成分，一般加1.0%(g/mL)溶液L0mL/L。

②用0.2mol/LNaOH或0.2mol/LHC1調整pH至7.1?7.2(如蒸儲水新鮮，

稱量準確無誤，配成后pH即為7.1?7.2,不必調整。實際應用時;若pH不準,

也可能是蒸偏水、試劑或稱量準確性問題)。使滲透壓穩定在約290毫摩爾滲透

壓濃度(mOsm)。

③如試劑含結晶水量與配方不符，應按分子量換算。對易吸潮的試劑，要

在配制前烘烤干燥。烘干溫度要查閱化學手冊，以不使試劑分解或損失分子中

的結晶水為原則。

④用G6濾器抽濾除菌，或用針頭濾器安裝濾膜后正壓過濾除菌。

⑤在制備過程中，特別是過濾、分裝時要嚴格遵守無菌操作規程。配制好

的液體分裝密封后，標明配制日期。4c冰箱中可保存1?4個月。不可在冰箱

冷凍室或低溫冰箱中保存，否則會有鹽類結晶析出。

⑥臨用前按需要量加入牛血清白蛋白或滅活的胎犢血清、新生犢牛血清。

一般在沖卵液中加入血清的濃度為2%?5%。為了使用方便，可在過濾前加入

血清，然后再過濾分裝。血清滅活可除去血清中的毒胚因子，滅活方法是把血

清在56℃下維持30111畝。

5.CZB液

CZB液為ChatotCL,ZiomekCA和BavisterBD于1989年發表的專為克服小

鼠胚胎體外培養中2.細胞阻滯的培養液，并以三人的名字縮寫簡稱為CZB液。

其基本組成成分見表3-2。其特點是在早期卵裂階段不使用可能導致胚胎發育延

遲和發育阻滯的葡萄糖，而使用谷氨酰胺克服小鼠胚胎的2-細胞阻滯。但早期

胚胎發育到后期，需要在含5.56mmol/L濃度葡萄糖的CZB液中培養48h,可

很好地支持桑甚胚發育到囊胚。近年來，CZB液及其改良液體常被用于小鼠胚

胎體外操作和培養的液體。

6.KSOM液

KSOM液最早為Lawitts和Biggers(1991,1992)發表的SOM液(simplex

optimizedmedium),可支持受精卵克服2-細胞阻滯。后來，SOM液的NaCl和

KC1濃度被提高后(Lawilts和Biggers1991,Erbachetal1994),新的液體被稱為

KSOMoKSOM液培養小鼠胚胎時，有較高的細胞體外培養分裂率，囊胚發育

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率較高。KSOM液的基本組成成分見表3-3。

表3-2CZB液成分

成分分子量含量(mmol)稱量(mg/L)

NaCl58.4481.624769.88

KC174.654.83360.56

KH.PO.136.091.18160.58

CaCVCaCL.2H20110.99/147.021.71186.9/251.4

MgSOi/MgSO4.7H2O120.37/246.471.18142.04/290.33

NallCO,84.0125.122110.33

乳酸鈉112.0731.33507.79

丙酮酸鈉110.050.2729.71

谷氨酰胺146.15L0（4-細胞前）146.15

葡萄糖180.165.56(4-細胞后)1001.69

EDTA（二鈉鹽）336.210.1136.98

牛血清白蛋白4000

青霉素70

鏈霉素50

酚紅10

表3-3KSOM液成分

成分分子量含量(mmol)稱量(mg/L)

NaCl58.4495.75592.7

KC174.652.48185.13

KH2P0」136.090.3547.63

MgSO>/MgSO,.7H2O120.37/246.470.2024.07/49.3

NallCO584.0125.02100.25

CaCl2/CaCl2.2H2110.99/147.021.71186.9/251.4

乳酸鈉112.0710.01120.7/60%,1870

丙酮酸鈉110.050.2022.01

葡萄糖180.160.2036.03

EDTA（二鈉鹽）336.210.013.36

牛血清白蛋白2000

青霉素60

鏈霉素50

酚紅10(1mL,1%)

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CZB液及KSOM液的配制方法：用四蒸水或超純水溶解NaCKK。、

KH2Po4、NaHCOs.乳酸鈉等基本成分及丙酮酸鈉、EDTA、青霉素、鏈霉素等

添加成分，共同組成A液；CaCb和MgSO4.7H2O分別溶解，為B、C液。將三

種液體在4℃冰箱降溫后混合，以防止沉淀，混合后用蒸鐳水定容。之后加入酚

紅(1%…L/mL,加入量1000|iL/L),觀察顏色并用精密試紙和儀器測定pH值,

并用0.2mol/LHC1或0.2mol/LNaOH調pH到7.3±0.1。用濾器進行細菌過濾,

分裝備用。谷氨酰胺、葡萄糖則先配成高濃度的母液，臨用時將母液加入培養

液而達到最終濃度；血清或BSA則分成小包裝，在臨用時加入培養液，血清終

濃度一般為10%?20%(V/V),BSA終濃度一般為4000mg/L。使用時按所需濃

度加入血清、BSA和谷氨酰胺后，用0.22um的濾膜再次進行細菌過濾。另外

需要注意的是，將BSA加入培養液時勿攪拌或劇烈晃動，以免產生大量泡沫，

應將所需量BSA撒在液體表面，待其自溶或輕輕晃動溶解。

五、實驗報告及思考題

1.詳細描述自己在實驗中配制液體的程序即方法，并思考下面的問題。

2.動物細胞工程所用操作液及培養液為何常用過濾除菌法除去細菌。

3.液體配制時為何要將組分分類溶解，然后混合？

4.培養液中的一些組分為何在使用前才能加入培養液？

實驗二小鼠睪丸、附睪及輸精管精子

采集、運動能力檢測與結構觀ZJ\

一、實驗目的

本實驗要求學生掌握小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集方法；掌握血球計

數板法精子計數和運動能力檢測的方法；通過睪丸、附睪及輸精管精子運動能

力檢測，認識精子在睪丸產生后，在附睪內成熟的過程；掌握精子抹片方法；

掌握染色法進行精子結構觀察和頂體結構觀察的方法，認識精子的正常結構。

二、實驗原理

17

哺乳動物的精子形成后必須經過在附睪內發生一系列形態、生理和生化方

面的變化而最終達到成熟后，才能獲得向前運動的能力，這種向前運動是精子

受精能力的重要指標。哺乳動物精子包括頭部和尾部二個主要部分，頸部介于

頭部和尾部之間，形成頭部和尾部的連接。精子頭部主要包括由核組成，頭部

前端是頂體，頂體包圍核的前端形成帽狀。精子頸部變細并形成頭部和尾部的

連接。尾部是精子的運動器官，可以分為中段、主段和末段。

三、實驗材料和用具

實驗人員用品，清洗用品和消毒、滅菌用品見實驗一。

精子采集與計數用品：隔水式恒溫培養箱，CZB液，KSOM液，注射器，

器械盤，銀子，手術剪，眼科剪，眼科鍛，眼科異物針，表玻皿，5mL試管，

體視顯微鏡，生物顯微鏡，擦鏡紙，恒溫水浴鍋，血球計數板.

精子結構觀察用品：吸水紙，滴瓶，滴管，載玻片，蓋玻片，剪刀，膠布,

記號筆。

操作液體：0.5%龍膽紫酒精；精子固定液（福爾馬林磷酸鹽緩沖液）；姬姆薩

液（原液，使用時以1：9的比例用磷酸鹽緩沖液配成工作液）。

實驗動物：選擇60日齡以上，體重達到35g的體成熟昆白系公鼠。

四、實驗方法

（一）精子采集

左手捏小鼠尾部，右手

持鑲子，或以圖3.1所示方

法，以頸部脫臼法處死實驗

鼠。仰臥,用用75%酒精棉

球消毒腹部開口部位被毛

及皮膚。剪開腹壁，暴露生圖3-1頸部脫臼法迅速處死小鼠的方法

（引自A.納吉等,2003）

殖系統（圖3-2A,B,圖

5-1,）。無菌采取分離睪丸、附睪及輸精管。在含培養液的表玻皿中，用眼科剪

除去睪丸、附睪及輸精管周圍的系膜及脂肪，并沖洗干凈，以免血液或脂肪球

混入液體妨礙精子觀察C

18

將分離并清洗干凈的睪丸、附睪及輸精管，用眼科剪再分離為睪丸、附睪

尾及附帶的小段輸精管、其余部分的輸精管三部分，棄去附睪頭。采集睪丸精

子時，將睪丸橫切為若干段或組織塊，放在表面皿中，力口1mL培養液，用眼科

鐐子輕輕擠壓睪丸組織塊,把精子擠入培養液中,去掉組織塊。于37℃、5%CCh、

飽和濕度條件下孵育20min,使精子自行散開。采集附睪尾精子時，將其剪成

幾段，用眼科鏡子輕輕擠壓附睪和輸精管，把精子擠入培養液中，去掉附睪和

輸精管。于37℃、5%CCh、飽和濕度條件下孵育20min,使精子自行散開。采

集輸精管精子時，由于小鼠輸精管非常細，不能直接沖洗管腔，將輸精管放入

含有1mL培養液的表面皿內，在立體顯微鏡下，用一支眼科用異物針固定輸精

管，用另一支異物針向相反方向縱向撕開輸精管，精子會浮游到稀釋液中。將

大塊輸精管組織撥開，用吸管連同精子吸出液體部分，裝于2mL具塞試管中暫

存。

（二）精子運動能力檢查

用滴管吸取精液，放于血球計數板的計數室與蓋玻片接觸處，使精液自然

流入計數室中。計數中間5個中方格（對角5個或四角及中間）內80個小方格的

精子數，計數值為X。計算時，先計數死精子的X1值，將計數板置于50c水浴

鍋中的搪瓷盤中，在50℃條件下lOmin殺死精子,計數總精子數X2值,（X2~X1）/X2

為精子運動能力°計數對每份精子用二個計數板重復計數二次.取平均值C

（三）精子整體結構觀察

取1小滴保存精液在載玻片上，將樣品滴以拉的形式制成抹片。用0.5%龍

膽紫酒精染色3min,自然干燥、水洗后鏡檢。鏡下可觀察到大多數為結構正常

的精子，部分為畸形精子，如頭部畸形（如頭部巨大、瘦小、細長、圓形、輪廓

不明顯、皺縮、缺損、雙頭等），頸部畸形（頸部膨大、纖細、屈折、不全、雙頸

等），尾部中段畸形（膨大、纖細、彎曲、屈折、不全、雙體等），尾部主段畸形（彎

曲、屈折、回旋、短小、長大、雙尾等）分類計數。有的精子尾部發育未完成，

為未成熟精子，可視為畸形精子。

（四）精子頂體結構觀察

精液抹片自然干燥2?20min,以1?2mL的福爾馬林磷酸鹽緩沖液固定

15min,水洗后自然干燥。用姬姆薩工作液染色90min,水洗，風干。置于1000

19

倍顯微鏡下用油鏡觀察、計數頂體異常精子。鏡下可觀察到大多數精子頂體結

構正常，部分精子頂體異常，精子頂體異常主要表現為腫脹、缺損、部分或完

全脫落。

五、實驗報告及思考題

1.詳細描述自己在實驗中進行小鼠睪丸、附睪及輸精管精子采集、運動能

力檢測及結構觀察的程序和方法。

2.雄性小鼠的生殖器官主要由哪幾部分組成？

3.我們為何要進行睪丸、附睪及輸精管精子運動能力檢測，從中能驗證什

么基礎理論問題？

4.繪制小鼠精子結構圖。

5.從外觀卜看小鼠精子由哪幾部分組成，你都觀察到了哪幾種畸形結構，

將典型的畸形結構進行圖示。

6.試述精子頂體的重要性，你都觀察到了哪兒種頂體異常情況。

實驗三小鼠輸卵管卵母細胞采集與結構觀ZJX

一、實驗目的

初步認識小鼠的雌性生殖器官結構組成及其位置，認識卵巢、輸卵管、子

宮等生殖器官；學會輸卵管壺腹部采集卵母細胞的方法，能在卵母細胞采集液

體中檢出卵母細胞，初步認識小鼠的卵母細胞內部及外部結構。

二、實驗原理

哺乳動物的卵子發生在卵巢的卵泡內進行。在卵母細胞成熟發育階段，初

級卵母細胞發生生發泡破裂（germinalvesiclebreakdown,GVBD）現象，并完成第

一次成熟分裂（減數分裂，以同源染色體分離為特征），并排出第一極體。一般認

為，GVBD的發生和第一極體的排出是卵母細胞核成熟的標志。之后，次級卵

母細胞進行第二次成熟分裂（一般為有絲分裂，以染色單體分離為特征），并停滯

在第二次成熟分裂中期。在這期間，完成胞質的最后成熟。這時，卵泡發育成

2()

熟，將處于第二次成熟分裂中期的卵母細胞連同周圍的卵丘細胞隨著卵泡液排

出。排出的卵母細胞經過輸卵管漏斗部進入輸卵管，運行到受精部位輸卵管膨

大部（壺腹部）。卵母細胞只有受精后才完全成熟，完成分裂后期和末期，接著

形成一個已受精的合子并放出一個小的第二極體。

三、實驗材料和用具

實驗人員用品，清洗用品和消毒、滅菌用品見實驗一。

激素分裝與稀釋用品：微量電子天平，藥勺，青霉素瓶，膠布，記號筆，

生理鹽水。

超數排卵用品：注射器（1mL）,針頭（5號半），孕馬血清促性腺素（PMSG）,

人絨毛膜促性腺素（hCG）,酒精棉球，鏡子。

卵母細胞采集及觀察用品：體視顯微鏡，擦鏡紙，恒溫水浴鍋，隔水式恒

溫培養箱，器械盤，手術剪，手術鏡子，眼科剪，眼科鏡子，眼科異物針，表

面皿，卵母細胞吸管及膠頭，檢卵杯，酒精棉球，吸管，注射器（2mL,5mL）,

針頭，針頭盒，胚胎回收操作液（mPBS）,酒精燈。

實驗動物及準備：昆白系小鼠。為了獲得較多的卵母細胞，需要對母鼠進

行超數排卵處理。一般情況下，達到性成熟的小鼠在超排時排卵數多于成年鼠,

故常使用剛達到性成熟的青年母鼠進行超排。一般選擇6周齡左右，體重22?

25g青年小鼠。從實驗動物飼養場購得的小鼠，需要在光控周期條件下飼養5?

7天，調節其生理周期，使其進入發情期。一般采用光照14h、黑喑10h的光

照周期。輸精管結扎公鼠的準備過程為，選擇60日齡以上的公鼠。于實驗前兩

周對公